全反式維甲酸聯(lián)合肝靶向免疫基因藥物對人肝癌細胞生長的影響.pdf

1、目的：目前肝癌的發(fā)病率和死亡率都比較高，單一用藥容易產(chǎn)生耐藥性，因此，聯(lián)合用藥成為肝癌治療的熱點之一。ATRA在臨床上用于部分實體瘤的治療，但由于其用藥劑量較大，毒副作用也較大，限制了其廣泛使用。轉(zhuǎn)鐵蛋白-脂質(zhì)-聚乙烯亞胺-DNA復合物(Tf-LPD)能夠有效沉默端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)從而達到對肝癌的治療目的。本實驗將ATRA與Tf-LPD聯(lián)合使用，以增強肝癌細胞對ATRA的敏感性，降低ATRA的用藥劑量，及二者聯(lián)合用藥對TERT基

2、因和蛋白的影響。
　　 方法：本研究分為三部分，首先制備轉(zhuǎn)鐵蛋白-脂質(zhì)-聚乙烯亞胺-DNA復合物(Tf-LPD復合物)，并考察其制劑學性質(zhì)；其次用Tf-LPD復合物轉(zhuǎn)染細胞，篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系，并確定ATRA單獨用藥量和用藥時間，ATRA與基因藥物聯(lián)合用藥量的確定；最后對兩藥聯(lián)用的RT-PCR結(jié)果和Western blot結(jié)果進行分析，考察二者聯(lián)用對TERT基因和蛋白的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.確定PEI/

3、DNA壓縮體的N/P摩爾比為10，liposome與pDNA的摩爾比值為200。Tf-LPD復合物的抗酶切能力較強，在血清中及4℃放置兩周條件下都比較穩(wěn)定，不會發(fā)生聚沉現(xiàn)象。轉(zhuǎn)染細胞后，Tf-LPD復合物對細胞的轉(zhuǎn)染能力明顯高于PEI/DNA縮合體和LPD復合物。
　　 2.將治療質(zhì)粒制備成Tf-LPD復合物，轉(zhuǎn)染細胞并成功篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系。ATRA單獨用藥作用于SMMC-7721細胞呈現(xiàn)出時間依賴性和劑量依賴性，確定ATRA

4、的合適用藥時間為用藥后48h，用藥濃度為1.41×10-4 mol·L-1，ATRA作用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系時，合適的用藥濃度為3.5×10-5mol·L-1。
　　 3.經(jīng)鑒定所提取的細胞總RNA降解和污染較少，質(zhì)量符合要求。PCR檢測結(jié)果為ATRA對TERT基因有抑制作用，Tf-LPD對TERT的抑制作用較強，兩藥聯(lián)用后對TERT的抑制作用增強，與單獨用藥相比具有統(tǒng)計學意義。用提取的細胞總蛋白進行Western blot檢測，結(jié)