大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞側(cè)腦室植入對(duì)SAH后CVS大鼠的影響.pdf

1、一、大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及神經(jīng)元條件培養(yǎng)基對(duì)其定向誘導(dǎo)分化
　　 二、大鼠SAH后CVS模型制備及行為學(xué)、生物學(xué)指標(biāo)測(cè)定
　　 三、BrdU標(biāo)記的BMSCs側(cè)腦室植入后對(duì)SAH后CVS大鼠行為學(xué)影響的研究
　　 目的：通過BMSCs側(cè)腦室植入SAH后CVS大鼠，觀察標(biāo)記的BMSCs在大鼠腦內(nèi)生長(zhǎng)情況，結(jié)合行為學(xué)檢測(cè)評(píng)價(jià)BMSCs植入后效果。
　　 方法：第5代BMSCs，用5-溴脫氧尿核

2、苷（Bromodeoxyuridine，BrdU）標(biāo)記2d。將標(biāo)記后的細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，一抗為BrdU抗體。標(biāo)記好的細(xì)胞以5×106的細(xì)胞懸液側(cè)腦室注入SAH后的大鼠。SAH大鼠以其神經(jīng)功能評(píng)分為參照，隨機(jī)分為三組：SAH組、SAH后植入DMEM組和SAH后BMSCs植入組。SAH組不植入干細(xì)胞，而DMEM組于第二次注血2d后立體定向儀下用微量注射器注入30μLDMEM培養(yǎng)基。BMSCs組在第二次注血后2d立體定位儀下注入3

3、0μL的BMSCs懸液。BMSCs組中5只大鼠于14d后進(jìn)行Morris水迷宮檢測(cè)，另外5只取腦進(jìn)行免疫組化染色。腦立體定位儀下大鼠側(cè)腦室穿刺取前囟定位，前囟后1.2mm，中線旁2mm處進(jìn)針，接上已事先抽好BMSCs懸液或是DMEM的微量注射器，深度為4.5mm，將30μLBMSCs懸液或DMEM培養(yǎng)基緩慢注入側(cè)腦室。各組大鼠在注射后14d麻醉，固定取腦，切片，進(jìn)行免疫組化染色，H2O2滅活內(nèi)源性酶，加入抗原修復(fù)液，生物微波爐加熱抗原修

4、復(fù)，滴加5％BSA封閉液，一抗（小鼠抗BrdUIgG），37℃1h，生物素化二抗，37℃20min，DAB染色，脫水透明，中性樹膠封片。SAH組及DMEM組、BMSCs組1d、2d、3d、5d、7d后行神經(jīng)生物學(xué)功能評(píng)分，于14d后進(jìn)行水迷宮檢測(cè)。
　　 結(jié)果：BrdU標(biāo)記后BMSCs，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色為胞核著色，以胞核呈棕黃色者為陽性。腦立體定位儀下行側(cè)腦室穿刺，以前囟定位，能準(zhǔn)確注入側(cè)腦室。SAH大鼠側(cè)腦室穿刺注入干細(xì)胞懸

5、液后無不良反應(yīng)。腦石蠟切片DAB染色后，可見經(jīng)BrdU標(biāo)記的陽性細(xì)胞胞核呈棕褐色，陽性細(xì)胞在切片內(nèi)無明顯規(guī)律，散在分布于陰性細(xì)胞之間。DMEM組可見陰性細(xì)胞核仍呈藍(lán)色。將SAH組、DMEM組及BMSCs組大鼠于注射后1d、2d、3d、5d、7d進(jìn)行神經(jīng)生物功能評(píng)分，無論是SAH組還是DMEM、BMSCs組可見，在各組里以1d神經(jīng)生物學(xué)功能評(píng)分普遍高于其它組（P<0.05），以后評(píng)分逐漸下降，BMSCs組大鼠在7d時(shí)與DMEM和SAH組相

6、比，神經(jīng)生物功能評(píng)分明顯減低，感覺運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)（P<0.05）。Morris水迷宮檢測(cè)BMSCs組大鼠平均逃避潛伏期時(shí)間比SAH組和DMEM組要短，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，探索實(shí)驗(yàn)顯示BMSCs組跨越平臺(tái)的次數(shù)多于其它兩組，差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　 結(jié)論：1BrdU可以用來標(biāo)記BMSCs，標(biāo)記后的細(xì)胞可用相應(yīng)的抗體檢測(cè)。2腦立體定位儀下以前囟后1.2mm，中線旁2mm處進(jìn)針，深度為4.5mm的位置能準(zhǔn)確注入側(cè)腦室，注射

7、后大鼠未見明顯不良反應(yīng)。3注入BrdU標(biāo)記過的BMSCs后，取前囟后4mm的海馬組織切片免疫組化染色顯示有BrdU陽性細(xì)胞存在。4生物學(xué)功能評(píng)分可見BMSCs組在7d時(shí)評(píng)分下降，表明感覺和運(yùn)動(dòng)功能有一定程度的恢復(fù)。5Morris水迷宮顯示BMSCs組在學(xué)習(xí)記憶能力方面也有一定的改善。
　　 四、SAH后CVS大鼠移植BMSCs后海馬神經(jīng)元凋亡的研究目的：大鼠SAH后CVS模型基礎(chǔ)上植入BMSCs，大鼠感覺、運(yùn)動(dòng)功能有一定程度的恢

8、復(fù)，進(jìn)一步觀察BMSCs植入后對(duì)大鼠腦內(nèi)海馬神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)的影響。
　　 方法：在第三部分大鼠腦組織切片基礎(chǔ)之上，取SAH組、DMEM組和BMSCs組14d前囟后4mm處大腦皮層及海馬組織石蠟切片，以兔抗鼠Bcl-2和Bax為一抗，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。圖像分析軟件分析陽性細(xì)胞數(shù)目比率。無菌條件下取SAH及BMSCs14d組大腦，剝出海馬，按每100mg腦組織加入1mL，裂解液，超聲裂解后低溫離心，取上

9、清，考馬斯亮蘭測(cè)定蛋白含量，蛋白變性后上樣，電泳、轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜（NC膜），脫脂奶粉封閉，分別加入兔抗大鼠Bcl-2、Bax一抗，4℃靜置過夜。滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，免疫化學(xué)發(fā)光，X光片顯影定影。使用Hema成像分析系統(tǒng)對(duì)顯色條帶進(jìn)行半定量分析，測(cè)定各組蛋白相對(duì)表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：與SAH組相比，BMSCs組海馬可見Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)目增加，細(xì)胞呈黃褐色，深染；Bax陽性細(xì)胞數(shù)目減少，著色較淺。SAH組大鼠海馬可見B

10、cl-2陽性細(xì)胞數(shù)目較少，著色淺；相反Bax陽性細(xì)胞數(shù)目增加，細(xì)胞呈棕褐色較深。DMEM組可見Bax陽性細(xì)胞數(shù)目增加，而Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)目相對(duì)減低。Westernblot顯示，DMEM組、SAH組和BMSCs組大鼠海馬GAPDH表達(dá)三組基本相似，Bcl-2在BMSCs組比DMEM組和SAH組表達(dá)高（P<0.05）。Bax的表達(dá)在SAH組與DMEM組高于BMSCs組，相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　 結(jié)論：1SAH

11、后CVS模型大鼠側(cè)腦室植入BMSCs后，大腦皮層和海馬內(nèi)可見神經(jīng)元抑制凋亡相關(guān)基因表達(dá)增加，而促凋亡相關(guān)基因表達(dá)下降。2SAH組14d大鼠腦內(nèi)促凋亡相關(guān)基因表達(dá)升高，抑制凋亡相關(guān)基因表達(dá)下降。3DMEM組大鼠腦內(nèi)僅有少量的抑制凋亡相關(guān)基因表達(dá)，促凋亡相關(guān)基因表達(dá)較高。
　　 五、SAH后CVS大鼠側(cè)腦室植入BMSCs腦血管超微結(jié)構(gòu)觀察與血中NOS、ET-1含量變化目的：觀察SAH后CVS大鼠側(cè)腦室植入BMSCs后血中一氧化氮合酶

12、、內(nèi)皮素-1含量變化，同時(shí)透射電鏡觀察大鼠腦內(nèi)血管和神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)改變，為細(xì)胞移植治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、SAH模型制備及BMSCs移植同前面幾部分，分為正常對(duì)照組、SAH組及BMSCs組。于移植BMSCs后1d、3d、7d進(jìn)行取血，測(cè)定大鼠血中NOS和ET-1含量，具體方法同前面第二部分。同時(shí)取前囟后4mm大腦皮層腦組織約1mm×1mm×2mm大小，用2.5％戊二醛磷酸鹽緩沖液中后固定1d，備透射電

13、鏡檢查。將標(biāo)本用0.1M磷酸緩沖液洗3次，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％鋨酸固定，逐級(jí)梯度乙醇、丙酮脫水，環(huán)氧樹脂812包埋，聚合，用超薄切片機(jī)作0.5μm厚度切片，經(jīng)1％甲苯胺藍(lán)-天青Ⅱ染色，光鏡下定位后制作超薄切片，片厚約50nm，銅網(wǎng)撈片，醋酸鈾、檸檬酸鉛液染色。日立H-7500型透射電鏡觀察各組大鼠大腦皮層神經(jīng)元及微血管的超微結(jié)構(gòu)，照相，記錄。組間比較采用單因素方差分析，各組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

14、>　　 結(jié)果：與對(duì)照組相比，SAH組后1d、3d、7d血中NOS含量明顯下降，而血中ET-1含量則明顯上升，其中以SAH3d組血中ET-1升高最為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與SAH組相比，BMSCs組可見血液中ET-1含量逐漸下降，而NOS含量上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與正常組相比，BMSCs組ET-1含量仍然較高，差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），血中NOS含量有一定下降，與對(duì)照組相比不能說明有差異（P>0.1）。透射電鏡顯示，對(duì)照

15、組神經(jīng)元細(xì)胞核大而圓，染色質(zhì)密度均勻，核仁明顯，核膜完整。大腦皮層毛細(xì)血管可見其內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)膜光滑，細(xì)胞核、細(xì)胞器、緊密連接清晰可見，內(nèi)皮細(xì)胞的基質(zhì)和基膜完整，層次清楚，管腔無狹窄。SAH組可見大腦皮層神經(jīng)元和微血管內(nèi)皮細(xì)胞的水腫程度達(dá)到高峰，神經(jīng)元高度水腫，線粒體腫脹，可見部分凋亡、壞死神經(jīng)元。BMSCs組大腦皮層神經(jīng)元和微血管內(nèi)皮細(xì)胞可見輕度水腫，血管內(nèi)皮細(xì)胞的吞飲小泡略減少。微血管內(nèi)皮細(xì)胞核固縮，管腔內(nèi)微絨毛減少，管腔狹窄有一定緩解