骨髓基質(zhì)細(xì)胞聯(lián)合粒細(xì)胞集落刺激因子治療大鼠脊髓全橫斷損傷.pdf

1、研究背景：
　　 脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的嚴(yán)重創(chuàng)傷,常導(dǎo)致不可逆的感覺及運(yùn)動(dòng)功能喪失和大小便失禁,致殘率高,對(duì)病人的生活造成極大的損害,給患者家庭及社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)。脊髓損傷的修復(fù)一直是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域中所面臨的一項(xiàng)挑戰(zhàn)性的任務(wù)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自我修復(fù)能力很差,脊髓損傷后機(jī)體經(jīng)歷原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷的過程,造成不同程度的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的壞死、凋亡,軸突的斷裂、脫髓鞘,脊髓損傷后早

2、期的病理變化主要是由于原發(fā)性損傷造成的中央出血性壞死,主要為神經(jīng)細(xì)胞、組織的壞死和脊髓的小血管出血,尤其是灰質(zhì)的許多小靜脈有明顯出血；隨之而來的繼發(fā)性損傷對(duì)脊髓的影響更大,它的機(jī)制涉及損傷部位脊髓缺血缺氧性改變、神經(jīng)組織能量代謝紊亂、興奮性氨基酸(EAA)毒性作用、神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)離子失衡(鈣超載)、細(xì)胞因子及凋亡學(xué)說、自由基損傷與脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、一氧化氮/一氧化氮合酶(NO/NOS)神經(jīng)毒性作用等,最終形成壞死囊腔、脊髓組織軟化或形成膠質(zhì)瘢

3、痕,這些繼發(fā)性損傷造成膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性膠質(zhì)化,瘢痕對(duì)軸突再生形成障礙,引起脊髓永久性功能喪失。因此如何替代原發(fā)性損傷造成的神經(jīng)細(xì)胞缺失和改善繼發(fā)性損傷造成的影響是治療脊髓損傷的一個(gè)重要課題。
　　 脊髓損傷的修復(fù)包括神經(jīng)元及軸突的再生、神經(jīng)元的整合和突觸的建立,神經(jīng)功能的重建,因此治療SCI要考慮下行的運(yùn)動(dòng)和上行的感覺纖維須再生修復(fù),損傷導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞死亡,包括運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和中間神經(jīng)元,須由正常神經(jīng)細(xì)胞替代。傳統(tǒng)的藥物及物理治療對(duì)

4、脊髓損傷后功能修復(fù)效果不佳,而干細(xì)胞替代治療是治療脊髓損傷的一個(gè)新的方向。干細(xì)胞可能通過以下機(jī)理在SCI修復(fù)中發(fā)揮作用:(1)神經(jīng)替代作用重建神經(jīng)元環(huán)路；(2)提供支持的環(huán)境促進(jìn)神經(jīng)元軸突的再生；(3)分泌的一些營(yíng)養(yǎng)因子改善脊髓內(nèi)的微環(huán)境,可以促進(jìn)部分損傷的神經(jīng)恢復(fù)部分功能。
　　 脊髓損傷后不利的微環(huán)境可能對(duì)移植入的細(xì)胞造成損傷,促使其凋亡,如何更好的改善微環(huán)境,使移植的細(xì)胞存活更好是當(dāng)前研究的一個(gè)重要方面。粒細(xì)胞集落刺激因子

5、(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)能參與神經(jīng)損傷的代償和保護(hù),減輕神經(jīng)損傷的程度,具有對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復(fù)作用。它可以對(duì)造血細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化起介導(dǎo)作用,具有刺激骨髓細(xì)胞增殖和成熟的生物學(xué)功能,是骨髓造血干細(xì)胞的動(dòng)員劑,可動(dòng)員大量的骨髓基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)入外周血循環(huán),并可刺激骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖和遷移。另外文獻(xiàn)報(bào)道,G-CSF可以明顯增加實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦損傷周圍區(qū)的nestin蛋白表達(dá),并降低腦缺血和

6、損傷的死亡率,能參與神經(jīng)損傷的代償和保護(hù),減輕神經(jīng)損傷的程度。有學(xué)者認(rèn)為G-CSF除具有造血刺激因子的功能外,還可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖,增加神經(jīng)系統(tǒng)損傷后血管的生成,并促進(jìn)血液中的骨髓基質(zhì)細(xì)胞遷移至損傷部位,分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞,并釋放一些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,可能通過抗凋亡、抗炎癥、促血管生長(zhǎng)及促神經(jīng)干細(xì)胞分化等多種機(jī)制促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復(fù)。
　　 因此我們希望通過體外培養(yǎng)擴(kuò)增獲得大量純化的骨髓基質(zhì)細(xì)胞,采用谷氨酸體外誘導(dǎo)模

7、擬脊髓損傷后細(xì)胞凋亡的環(huán)境,并通過觀察粒細(xì)胞集落刺激因子對(duì)谷氨酸處理的骨髓基質(zhì)細(xì)胞存活率的影響,了解粒細(xì)胞集落刺激因子對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響。另外建立穩(wěn)定的大鼠脊髓全橫斷動(dòng)物模型,采用骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植聯(lián)合粒細(xì)胞集落刺激因子治療,通過觀察動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)功能,組織學(xué)檢查,細(xì)胞的凋亡檢查來判斷聯(lián)合治療對(duì)脊髓損傷的療效.
　　 研究目的:
　　 1.探索不同濃度的谷氨酸和大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞存活率的影響;

8、>　　 2.探索不同濃度的粒細(xì)胞集落刺激因子對(duì)谷氨酸和大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)后細(xì)胞存活率的的影響；
　　 3.探索骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植聯(lián)合粒細(xì)胞集落刺激因子對(duì)大鼠脊髓全橫斷損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。
　　 第一部分 大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定及谷氨酸對(duì)其存活率的影響
　　 目的：建立大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞在體外培養(yǎng)和擴(kuò)增方法,并從細(xì)胞形態(tài)、標(biāo)志性蛋白的表達(dá)鑒定所獲得的細(xì)胞；采用不同濃度谷氨酸和骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng),了解谷氨

9、酸對(duì)大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞存活率的影響。
　　 方法:無菌條件下取大鼠股骨脛骨,應(yīng)用密度梯度離心法分離骨髓基質(zhì)細(xì)胞,體外貼壁培養(yǎng)純化及擴(kuò)增骨髓基質(zhì)細(xì)胞,相差顯微鏡下觀察骨髓基質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征,免疫組化法檢測(cè)骨髓基質(zhì)細(xì)胞表面的CD34、CD44、CD29、CD90蛋白表達(dá),熒光顯微鏡下觀察其結(jié)果；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表面CD34、CD44、CD29、CD90的表達(dá)；實(shí)驗(yàn)分組:A組為對(duì)照組,為不加谷氨酸的骨髓基質(zhì)細(xì)胞,B、C、D組分別為

10、加入10、30、50mmol/l的谷氨酸和骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)24h,用Hoechst33342做熒光染色,熒光顯微鏡觀察并記錄各組高倍鏡下50個(gè)細(xì)胞中正常和異常細(xì)胞的數(shù)量,計(jì)算各組細(xì)胞的存活率,采用one-way ANOVA統(tǒng)計(jì)各組細(xì)胞存活率的差異,方差齊性時(shí)用LSD檢驗(yàn),方差不齊時(shí)用Dunnett T3檢驗(yàn),P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；流式細(xì)胞儀采用Annexin-V/PI染色檢測(cè)各組細(xì)胞的存活率和凋亡、壞死率。
　　 結(jié)論

11、:1.采用密度梯度離心法和貼壁培養(yǎng)法可獲得骨髓基質(zhì)細(xì)胞,經(jīng)傳代后細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),增殖旺盛,純化程度高；
　　 2.大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志為CD 29、CD 44、CD90陽(yáng)性,CD34陰性；
　　 3.谷氨酸可以誘導(dǎo)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞凋亡,隨著谷氨酸濃度的增加,細(xì)胞的壞死和凋亡率增加。
　　 第二部分 粒細(xì)胞集落刺激因子對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響
　　 目的：采用不同濃度的粒細(xì)胞集落刺激因子和骨髓基

12、質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng),然后用谷氨酸誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的凋亡,了解粒細(xì)胞集落刺激因子對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響。
　　 方法:按照第一部分方法獲得骨髓基質(zhì)細(xì)胞,體外培養(yǎng)純化及擴(kuò)增骨髓基質(zhì)細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)分組為A、B、C、D四組,分別為正常BMSCs對(duì)照組及應(yīng)用0、10、50ng/ml的G-CSF和骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)6h后加入30mmol/l谷氨酸繼續(xù)培養(yǎng)24h,各組均用Hoechst33342做熒光染色,熒光顯微鏡觀察并記錄高倍鏡下50

13、個(gè)細(xì)胞中正常和異常細(xì)胞的數(shù)量,計(jì)算各組細(xì)胞的存活率,采用one-way ANOVA統(tǒng)計(jì)各組細(xì)胞存活率的差異,方差齊性時(shí)用LSD檢驗(yàn),方差不齊時(shí)用Dunnett T3檢驗(yàn),P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；流式細(xì)胞儀采用Annexin-V/PI染色檢測(cè)各組細(xì)胞的存活率和凋亡,壞死率。
　　 結(jié)論:體外實(shí)驗(yàn)中一定濃度的G-CSF可以減低谷氨酸誘導(dǎo)的BMSCs凋亡和壞死,提高細(xì)胞的存活率。
　　 第三部分 骨髓基質(zhì)細(xì)胞聯(lián)合粒細(xì)胞集

14、落刺激因子治療大鼠脊髓全橫斷損傷
　　 目的：制作大鼠脊髓全橫斷損傷模型,移植骨髓基質(zhì)細(xì)胞,并聯(lián)合應(yīng)用粒細(xì)胞集落刺激因子,觀察其對(duì)大鼠脊髓全橫斷損傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。
　　 方法:按照第一部分方法體外培養(yǎng)純化及擴(kuò)增骨髓基質(zhì)細(xì)胞,用Hoechst33342做細(xì)胞的標(biāo)記,分組行BMSCs和G-CSF治療。取雌性SD大鼠60只,隨機(jī)分為4組,每組15只。A組(對(duì)照組),大鼠行脊髓全橫斷手術(shù),術(shù)后注射生理鹽水對(duì)照；B組(G-

15、CSF治療組),大鼠行脊髓全橫斷手術(shù)后給以G-CSF 50ng/kg/d,連用5天后停止；C組(BMSCs治療組),大鼠行脊髓全橫斷手術(shù)后給以10μl含有3×106個(gè)BMSCs損傷部位直接注射；D組(BMSCs+G-CSF治療組),大鼠行脊髓全橫斷手術(shù)后給以10μl含有3×106BMSCs損傷部位直接注射,同時(shí)給以G-CSF 50ng/kg/d,連用5天后停止。術(shù)后每組9只大鼠每周觀察其下肢BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分,連續(xù)8周,采用重復(fù)測(cè)量的方

16、差分析檢驗(yàn)每周時(shí)各組大鼠BBB評(píng)分差異；并在2周、4周、8周后每組各3只鼠用于取材做免疫組化,HE染色等觀察損傷部位的情況變化,計(jì)數(shù)2周時(shí)各組caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞,4周時(shí)NSE、GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量,采用one-way ANOVA檢驗(yàn)各組陽(yáng)性細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)差異,方差齊性時(shí)用LSD檢驗(yàn),方差不齊時(shí)用Dunnett T3檢驗(yàn),P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論:
　　 1.粒細(xì)胞集落刺激因子可以抑制脊髓全橫斷大鼠