γ-分泌酶抑制劑DAPT封閉Notch信號(hào)途徑對(duì)新生大鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化影響的體外研究.pdf

1、目的:觀察γ-分泌酶抑制劑DAPT在不同時(shí)間點(diǎn)封閉Notch信號(hào)通路后NSC增殖、分化的情況，探究選擇封閉Notch信號(hào)通路的最佳時(shí)機(jī)。
　　方法:(1) NSC的培養(yǎng)與鑒定:①用彎頭手術(shù)刀將分離出的新生SD大鼠（2-3天內(nèi)）腦組織切成小碎塊（約1 mm3），經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過濾形成的單細(xì)胞懸液在含有生長因子的無血清專用培養(yǎng)基內(nèi)懸浮培養(yǎng)，并且使用TrypLTM Express消化聯(lián)合機(jī)械吹打法進(jìn)行傳代。②對(duì)傳至第5代的培養(yǎng)細(xì)胞，通

2、過免疫熒光染色法鑒定神經(jīng)干細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志物Nestin及經(jīng)5％胎牛血清誘導(dǎo)分化后NSE、GFAP的表達(dá)。(2)脊髓提取液的制備:隨機(jī)將15只健康的雌性成年SD大鼠分成三組，每組5只:癱瘓組用WD法制作T9平面完全性截癱的SD大鼠脊髓損傷模型，假手術(shù)組在相同節(jié)段僅做椎板開窗，正常組不做處理，造模5d后制備各組脊髓提取液。(3)取第5代NSC隨機(jī)分成七組:A組-空白對(duì)照組（即培養(yǎng)基中加入PBS液共同培養(yǎng)），B組-正常組（即培養(yǎng)基中加入

3、正常脊髓提取液共同培養(yǎng)），C組-假手術(shù)組（即培養(yǎng)基中加入假手術(shù)脊髓提取液共同培養(yǎng)），D組-癱瘓組（即培養(yǎng)基中加入癱瘓脊髓提取液共同培養(yǎng)），E組-正常+DAPT組（即NSC培養(yǎng)基中加入正常脊髓提取液共同培養(yǎng)24h后加入DAPT），F(xiàn)組-假手術(shù)+DAPT組（即培養(yǎng)基中加入假手術(shù)脊髓提取液共同培養(yǎng)24h后加入DAPT）及G組-癱瘓+DAPT組（即培養(yǎng)基中加入癱瘓脊髓提取液共同培養(yǎng)24h后加DAPT）。各組培養(yǎng)1d、2d、3d、4d、5d后，用

4、細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)量各組神經(jīng)干細(xì)胞的增殖情況，且各組分別于培養(yǎng)24 h、48h后提取神經(jīng)干細(xì)胞的總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶聯(lián)反應(yīng)法(RT-PCR)測(cè)量神經(jīng)干細(xì)胞Notch信號(hào)通路中的Notch1和Hes1 mRNA的表達(dá)水平。(4)取NSC隨機(jī)分成兩組:Ⅰ組對(duì)照組（培養(yǎng)基中加入癱瘓脊髓提取液共同培養(yǎng)）和Ⅱ組處理組（培養(yǎng)基中加入癱瘓脊髓提取液共同培養(yǎng)，分別于共同培養(yǎng)1d、2d、3d、5d、7d時(shí)加入γ-分泌酶抑制劑DAPT封閉Notch信號(hào)通

5、路，DAPT終濃度為50umol/L），5％胎牛血清誘導(dǎo)分化48小時(shí)后，計(jì)算各組各封閉時(shí)間NSE陽性細(xì)胞（神經(jīng)元）以及GFAP陽性細(xì)胞（星形膠質(zhì)細(xì)胞）所占的百分率和剩余干細(xì)胞數(shù)。各個(gè)指標(biāo)用-x±s即均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。
　　結(jié)果:(1)神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定結(jié)果:新生SD大鼠（2-3天內(nèi)）腦源性細(xì)胞在體外可以大量擴(kuò)增、形成球狀團(tuán)聚物，而且可以連續(xù)的、穩(wěn)定的傳代。培養(yǎng)到第5代的細(xì)胞Nesti

6、n免疫熒光染色(+)，誘導(dǎo)分化后可出現(xiàn)GFAP、NSE免疫熒光染色呈陽性的細(xì)胞。(2)封閉notch信號(hào)通路后，與A、B、C組比較，E、F組在各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)和Notch1、Hes1 mRNA的表達(dá)量明顯降低(P＜0.05);與D組比較，G組在各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)和Notch1、Hes1 mRNA的表達(dá)量明顯降低(P＜0.05);與E、F組比較，G組在各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)和Notch1、Hes1 mRNA的表達(dá)量較高(P＜0.05);而A、B、

7、C組之間在各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)和Notch1、Hes1 mRNA的表達(dá)量無明顯差異(P＞0.05);E、F組之間在各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)和Notch1、Hes1 mRNA的表達(dá)量無明顯差異（P＞0.05）;D組、G組24h的Notch1與Hes1 mRNA的平均表達(dá)量均低于48h的，但差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。(3)封閉notch信號(hào)通路后，與Ⅰ組對(duì)照組相比，Ⅱ組處理組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的干細(xì)胞數(shù)較少(P＜0.05)，Ⅱ組處理組在共同培養(yǎng)2d

8、、3d時(shí)加入DAPT，NSE陽性細(xì)胞（神經(jīng)元）的百分率較高、GFAP陽性細(xì)胞（星形膠質(zhì)細(xì)胞）的百分率較低(P＜0.05);Ⅱ組處理組組內(nèi)數(shù)據(jù)分析:在共同培養(yǎng)1d時(shí)加入DAPT的干細(xì)胞數(shù)明顯少于共同培養(yǎng)2d、3d、5d、7d時(shí)加入DAPT(P＜0.05)，而在共同培養(yǎng)5d、7d時(shí)加入DAPT，其分化細(xì)胞數(shù)明顯少于共同培養(yǎng)2d、3d時(shí)加入DAPT(P＜0.05)。
　　結(jié)論:1.新生SD大鼠腦源性細(xì)胞不僅擁有擴(kuò)增更新、分化成多類神經(jīng)細(xì)