痛風(fēng)寧對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠HSP70表達(dá)的影響.pdf

1、1、研究背景與目的
　　 痛風(fēng)(gout)是由于嘌呤類物質(zhì)代謝紊亂，尿酸產(chǎn)生過多和（或）尿酸排泄減少，血尿酸濃度持續(xù)增高導(dǎo)致尿酸鹽結(jié)晶沉積軟組織所致的一組代謝性疾病。其臨床特點(diǎn)為由高尿酸血癥、尿酸鹽沉積所導(dǎo)致的反復(fù)發(fā)作性的急、慢性關(guān)節(jié)炎和軟組織損傷，尿酸性腎結(jié)石所導(dǎo)致的痛風(fēng)性腎病。近年來，由于生活方式的變化，發(fā)病率明顯增加。我國普通人群中高尿酸血癥患病率約為10％，痛風(fēng)患病率約為0.58％。其中急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是成年男性最常見的

2、炎癥性關(guān)節(jié)炎，且呈年輕化趨勢。
　　 痛風(fēng)分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類。原發(fā)性痛風(fēng)其病因及發(fā)病機(jī)理至今尚未完全弄清，但其發(fā)生必需具備以下兩個基本條件:
　　 (1)尿酸生成過多嘌呤代謝受一些酶的調(diào)節(jié)，研究表明原發(fā)性痛風(fēng)與遺傳缺陷導(dǎo)致這些酶的缺乏或活性改變有關(guān)。
　　 (2)尿酸排泄減少腎小球的濾過減少導(dǎo)致高尿酸血癥主要見于慢性腎臟疾病引起腎功能衰竭，還有腎排尿酸閾值增高。
　　 原因未明。腎小管尿酸排泄減少與

3、一些尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有關(guān)，其參與近曲腎小管對尿酸鹽的主動分秘和重吸收，其異常與基因變異有關(guān)。繼發(fā)性痛風(fēng)多見于慢性腎病致腎功能減退，尿酸排泄減少（糖尿病酮癥酸中毒、乳酸酸中毒等）、血液病、腫瘤化療藥引起核酸轉(zhuǎn)換增加，尿酸生成增多或某些藥物如噻嗪類利尿藥、速尿、小劑量乙酰水楊酸;環(huán)孢素A、乙胺丁醇、乙醇、乳酸等代謝產(chǎn)物可抑制腎小管排泄尿酸導(dǎo)致尿酸升高。
　　 急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是由于尿酸鈉(MSU)微晶體在關(guān)節(jié)周圍組織沉積引起的急性炎癥

4、反應(yīng)，其發(fā)病機(jī)制及自我緩解機(jī)制還不是很清楚。高尿酸血癥中MSU結(jié)晶形成并沉積在軟骨、滑膜及關(guān)節(jié)周圍，平時無炎癥表現(xiàn)。在某些因素作用下（如寒冷、創(chuàng)傷及飲酒等），結(jié)晶脫落進(jìn)入關(guān)節(jié)腔，引起炎癥級聯(lián)反應(yīng)。
　　 中醫(yī)學(xué)中亦有“痛風(fēng)”之名，元代朱丹溪明確地提出“痛風(fēng)”的病名，“痛風(fēng)者，四肢百節(jié)走痛，方書謂之白虎歷節(jié)風(fēng)證是也。大率有痰，風(fēng)熱，風(fēng)濕，血虛”。后代醫(yī)家將痹證中的痛痹、或痛痹與行痹并列稱之為痛風(fēng)，或白虎歷節(jié)風(fēng)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，痛風(fēng)的病

5、因病機(jī)為先天稟賦不足，飲食勞倦，損傷脾腎，陽氣虧損，寒濕內(nèi)盛，瘀濁阻滯，且其寒之邪，多由外受，其濕之盛，皆因于內(nèi)，屬于本虛標(biāo)實(shí)，虛實(shí)夾雜。先天稟賦、飲食勞倦與脾腎關(guān)系密切。脾主升清降濁，腎主蒸騰氣化，膏粱厚味，損傷脾胃，脾失健運(yùn)，升清降濁失司;腎失溫煦，氣化不足，均致寒濕內(nèi)盛，氣血運(yùn)行不暢，流注經(jīng)絡(luò)骨節(jié)，凝滯不化，愈滯愈甚，閉阻經(jīng)絡(luò)，致使肢體關(guān)節(jié)疼痛，日久瘀血濕濁膠著，因寒而聚結(jié)，附于骨節(jié)，變生痛風(fēng)結(jié)節(jié)，然后僵硬成石，致關(guān)節(jié)畸形，久病人

6、腎，腎氣虧乏，陽微而致腎衰。
　　 熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)，又稱應(yīng)激蛋白，是生物細(xì)胞在應(yīng)激原如受熱、缺血、缺氧、創(chuàng)傷、饑餓等刺激后，發(fā)生熱休克反應(yīng)時所產(chǎn)生的一組高度保守的蛋白質(zhì)。HSP能快速、短暫地調(diào)整應(yīng)激過程中細(xì)胞的存活機(jī)能，保護(hù)細(xì)胞，抗御損傷，并有助于細(xì)胞恢復(fù)正常的結(jié)構(gòu)與機(jī)能。HSP70是其中最保守和最重要的一族，在大多數(shù)生物中含量最多，在應(yīng)激反應(yīng)中最敏感以及在臨床實(shí)踐中有多種作用。HSP

7、70主要具有以下主要生物學(xué)功能:分子伴侶作用、防止細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖、具有免疫作用、使生物獲得耐熱性。
　　 最近研究表明，HSP70可參與免疫反應(yīng)和抑制炎癥反應(yīng)，其在受損細(xì)胞表面的表達(dá)可幫助免疫系統(tǒng)識別清除毒性細(xì)胞。并可通過抑制活性氧簇和細(xì)胞因子起保護(hù)細(xì)胞和組織免受炎癥損傷的作用。HSP70可協(xié)助抗原提呈細(xì)胞將抗原提呈給T細(xì)胞參與細(xì)胞免疫，抑制IL-1、TNF-α等炎癥介質(zhì)的表達(dá);HSP70能通過阻礙P38絲裂原激活蛋白激

8、酶所介導(dǎo)的信號通路，抑制IKB在細(xì)胞漿磷酸化及其降解，從而抑制NF-κB從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，抑制NF-κB的激活，抑制炎癥介質(zhì)TNF-a、IL-6等的釋放，減輕炎癥反應(yīng);因此HSP70的表達(dá)可能對痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎炎癥的發(fā)生發(fā)展具有一定的影響作用。
　　 在GA臨床治療上，中醫(yī)藥有明顯優(yōu)勢，具有從整體治療，副反應(yīng)少，臨床療效好，可長期服用的特點(diǎn)。痛風(fēng)寧是多年用于治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的經(jīng)驗(yàn)方，具有清利痰濁、活血通絡(luò)、理氣止痛之功效，用于治

9、療痰濕瘀阻證的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎臨床效果良好。其藥物組成有:蒼術(shù)、黃柏、牛膝、薏苡仁、土茯苓、川萆薢、毛冬青、威靈仙、虎杖等。既往藥理研究顯示痛風(fēng)寧沖劑具有顯著的止痛、抑制炎癥作用，但其具體的抗炎機(jī)制尚不明確。
　　 本課題采用痛風(fēng)寧治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠，并通過檢測急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠受試關(guān)節(jié)滑膜組織中熱休克蛋白的基因表達(dá)和蛋白合成情況，探討熱休克蛋白在炎癥過程中發(fā)揮的作用，明確痛風(fēng)寧是否通過對熱休克蛋白表達(dá)的影響而對急性痛風(fēng)性關(guān)

10、節(jié)炎產(chǎn)生抗炎作用，為進(jìn)一步開發(fā)痛風(fēng)寧提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為利用熱休克蛋白誘導(dǎo)劑防治急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎提供一定的思路。
　　 2、方法與內(nèi)容
　　 2.1.中藥復(fù)方痛風(fēng)寧組成:蒼術(shù)、黃柏、牛膝、薏苡仁、土茯苓、川萆薢、毛冬青、威靈仙、虎杖等。
　　 2.2.急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型制作:關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入尿酸鈉結(jié)晶溶液，誘導(dǎo)急性關(guān)節(jié)炎模型。
　　 2.3.實(shí)驗(yàn)方法:雄性Wistar大鼠50只，隨機(jī)分為空白組、模型組、西

11、藥組、中藥高劑量組、中藥低劑量組，每組10只。中藥高劑量組30g/kg/日，中藥低劑量15g/kg/日，西藥對照0.09mg/kg/日的秋水仙堿，模型組、空白組灌服生理鹽水，每天2次，連用5天，并與用藥的第三天造模型，造模型前1h測大鼠右踝關(guān)節(jié)周徑，造模后24小時觀察大鼠步態(tài)，造模后48時再測右踝關(guān)節(jié)周徑，處死，取血，檢測IL-1、IL-10;取滑膜，提取RNA，HE染色及免疫組化染色。
　　 2.4.檢測指標(biāo):
　　

12、2.4.1.一般情況:大鼠神態(tài)，步態(tài)，活躍程度等。
　　 2.4.2.滑膜病理:大鼠受試關(guān)節(jié)滑膜病理改變情況。
　　 2.4.3.HSP70合成情況檢測:采用LSAB免疫組化標(biāo)記法。
　　 2.4.4.HSP70mRNA表達(dá)檢測:采用實(shí)時定量—聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測。
　　 2.4.5.血清IL-1、IL-10檢測:采用ELISA法檢測。
　　 2.5.資料統(tǒng)計(jì):
　　 用SPS

13、S13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以x±s表示，SPSS13.0軟件包處理數(shù)據(jù)，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，方差不齊采用近似F檢驗(yàn)Welch法，DunnettT3進(jìn)行多重比較;方差齊性采用LSD進(jìn)行多重比較。P＜0.05為存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.01為具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3、結(jié)果
　　 3.1.一般情況整個實(shí)驗(yàn)期間，正常組大鼠毛發(fā)光澤，雙目有神，反應(yīng)敏捷，進(jìn)食正常;秋水仙堿組、中藥痛風(fēng)寧組、模型組大鼠在給予

14、致炎后出現(xiàn)致炎足踝腫脹，患足不能著地，出現(xiàn)三足步態(tài)，活動嚴(yán)重受限。經(jīng)治療后秋水仙堿組、中藥痛風(fēng)寧組上述癥狀明顯好轉(zhuǎn)，模型組大鼠癥狀改善不明顯。
　　 3.2.痛風(fēng)寧對大鼠病理形態(tài)的影響:正常組大鼠關(guān)節(jié)滑膜正常，模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜襯里層細(xì)胞明顯增厚，損傷部位及周圍可見炎細(xì)胞成堆，多形核白細(xì)胞、單核細(xì)胞、異物巨細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤;新生血管多處可見，血管腔明顯擴(kuò)張充血;痛風(fēng)寧組及秋水仙堿組，其炎性白細(xì)胞浸潤、血管擴(kuò)張情況均不同程度低于

15、模型組
　　 3.3.HSP70表達(dá)情況: Levene檢驗(yàn)方差齊性（F=0.078，P=0.989），采用LSD法檢驗(yàn)。各組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=74.525，P=0.000）?？瞻捉MHSP70表達(dá)最低，模型組略高于空白組但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.195);西藥組、中藥低劑量、中藥高劑量組均高于模型組(P=0.000，P=0.000，P=0.000)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;西藥組、中藥高劑量組表達(dá)高于中藥低劑量組(P=0.000

16、，P=0.000)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;西藥組、中藥高劑量組表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.418)。
　　 3.4.HSP70mRNA的表達(dá)情況:Levene檢驗(yàn)方差齊性（F=1.040，P=0.395），采用LSD法檢驗(yàn)。各組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=35.778，P=0.000）?？瞻捉MHSP70mRNA表達(dá)最低，模型組略高于空白組(P=0.123)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;西藥組、中藥低劑量、中藥高劑量組均高于模型組(P=0.000

17、，P=0.000，P=0.000)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;西藥組、中藥高劑量組表達(dá)高于中藥低劑量組(P=0.001，P=0.003)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;西藥組、中藥高劑量組表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.604)。
　　 3.5.血清IL-1β、IL-10:血清IL-1β、IL-10指標(biāo)各組之間比較:①IL-1β含量:Levene檢驗(yàn)方差不齊（F=8.109，P=0.000），采用Welch法近似方差分析。各組間IL-1β含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)

18、學(xué)意義(F=341.297，P=0.000)。組間兩兩比較，模型組高于正常組、西藥組、中藥高、低劑量組（P=0.000，P=0.000，P=0.000，P=0.000）。西藥組與中藥高低于中藥低劑量組(P=0.000，P=0.000)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。西藥組與中藥高劑量組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000)。②IL-10含量:Levene檢驗(yàn)方差不齊(F=4.938，P=0.002)，采用Welch法近似方差分析。各組間IL-10

19、含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=47.969，P=0.000)。組間兩兩比較，模型組低于空白組、西藥組、中藥高、低劑量組（P=0.000，P=0.000，P=0.000，P=0.000）;西藥組與中藥高劑量組均高于中藥低劑量組比較（P=0.017，P=0.011），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。西藥組與中藥高劑量組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=1.000）。
　　 4、結(jié)論
　　 1.HSP70作為一種保護(hù)因子可減輕急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的