VEGF基因修飾MSC移植促進(jìn)放射性腦損傷后腦微血管新生的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、放射性腦損傷(radiation injuries，brain；RIB)是頭頸部惡性腫瘤放射治療后常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，原發(fā)腫瘤在得到放射治療的同時(shí)，RIB的出現(xiàn)成為限制腦部放射劑量、影響療效和降低病人生存質(zhì)量的重要因素。目前臨床對(duì)RIB治療以抗氧化、脫水劑、激素及對(duì)癥支持治療為主，無(wú)法從根本上逆轉(zhuǎn)其病情變化，所以尋找有效的治療方法十分必要。本課題組前期實(shí)驗(yàn)曾嘗試堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)轉(zhuǎn)染C17.2神經(jīng)干細(xì)胞移植治療，發(fā)現(xiàn)對(duì)

2、RIB有一定的治療作用。引起RIB特別是晚期RIB的病理機(jī)制尚未完全闡明，近年來(lái)對(duì)放射性腦病發(fā)生機(jī)制的研究主要集中在血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和血腦屏障破壞方面。血管壁各成分中以內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)放射線最敏感。有研究顯示，單次大劑量照射后24小時(shí)就可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡損失，這種損失可以持續(xù)52周，最后導(dǎo)致40％～65％的血管內(nèi)皮損失。大量的內(nèi)皮細(xì)胞損失導(dǎo)致微血管床破壞，伴隨微血管床破壞是微循環(huán)的明顯障礙，并導(dǎo)致腦的供血供氧減少，最終出現(xiàn)腦細(xì)胞壞死、脫髓鞘等病

3、理改變。特別是側(cè)支循環(huán)不發(fā)達(dá)的白質(zhì)，可出現(xiàn)片狀白質(zhì)壞死。所以微血管內(nèi)皮細(xì)胞可能是RIB的最主要效應(yīng)細(xì)胞。由此可見(jiàn)，尋找以腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞再生為治療靶點(diǎn)的方法可能是治療RIB的最有效手段。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種最為有效的促血管生成因子，已有很多研究證實(shí)往缺血部位導(dǎo)入VEGF可以顯著誘導(dǎo)血管新生。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，

4、MSC)是有多項(xiàng)分化潛能的成體干細(xì)胞，來(lái)源廣泛，易于分離和培養(yǎng)，也是基因治療的一種合適的工具細(xì)胞?；蚵?lián)合細(xì)胞移植治療已經(jīng)在血管再生工程學(xué)上得到廣泛應(yīng)用。本研究的目的：構(gòu)建VEGF基因重組腺病毒(為便于在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中區(qū)別轉(zhuǎn)基因VEGF和宿主內(nèi)源性的VEGF，我們?cè)赩EGF目的片斷上添加一個(gè)HA標(biāo)簽)，轉(zhuǎn)染MSC，植入放射后大鼠腦微血管損傷區(qū)，觀察其分泌VEGF，是否可以促進(jìn)該部位血管新生，改善腦功能。本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容分為三部分： 1、A

5、d—VEGF—HA重組腺病毒的構(gòu)建和鑒定； 2、Ad—VEGF—HA重組腺病毒轉(zhuǎn)染MSC和VEGF的表達(dá)及其分泌； 3、VEGF聯(lián)合MSC移植治療促進(jìn)放射性腦微血管內(nèi)皮的新生。 第1章 Ad—VEGF—HA重組腺病毒的構(gòu)建和鑒定 研究目的： 構(gòu)建Ad—VEGF—HA重組腺病毒并進(jìn)行鑒定。 研究方法： pcDNA3.0-VEGF—HA(質(zhì)粒為山東大學(xué)張剛博士饋贈(zèng))測(cè)序后行EcorⅠ

6、和KpnⅠ雙酶切回收，與用同樣酶切回收的pAdtrack—CMV質(zhì)粒連接為pAdtrack—CMV—VEGF—HA，連接質(zhì)粒用Pme1酶切，回收目的片斷后與pAdeasy共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183、DH5a，鑒定后用Pac1酶切回收轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞進(jìn)行包裝。約10天后細(xì)胞病變比較完全和細(xì)胞內(nèi)綠色熒光變?nèi)鯐r(shí)，回收、反復(fù)凍融HEK293A細(xì)胞，離心回收上清行酶切、電泳鑒定和病毒滴度測(cè)定。 結(jié)果： 1.鑒定pAdtrac

7、k—CMV—VEGF—HA穿梭質(zhì)粒、pAdeasy—CMV—VEGF—HA整合質(zhì)粒和重組腺病毒基因組內(nèi)含VEGF—HA基因。 2.HEK293A細(xì)胞內(nèi)熒光顯示病毒包裝成功。病毒滴度約為T≈1×1011GTU/mL。 結(jié)論： 成功構(gòu)建Ad—VEGF—HA重組腺病毒，為下一步轉(zhuǎn)染MSC做好準(zhǔn)備。 第2章 Ad—VEGF—HA重組腺病毒轉(zhuǎn)染MSC和VEGF的表達(dá)及其分泌 研究目的： 將Ad—VE

8、GF—HA重組腺病毒轉(zhuǎn)染入MSC內(nèi)，使MSC穩(wěn)定表達(dá)并分泌VEGF。 研究方法： 全骨髓法(直接培養(yǎng)法)獲取SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。MSC傳兩代后將細(xì)胞接種于25c㎡培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)至90％融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。添加Ad—VEGF—HA重組腺病毒0.5ml(MOI=50)，轉(zhuǎn)染3小時(shí)后更換培養(yǎng)液，48小時(shí)后觀察轉(zhuǎn)化效率。免疫組化和方法測(cè)定VEGF表達(dá)。ELISA法檢測(cè)重組MSC細(xì)胞分泌的VEGF。 結(jié)果： 1.

9、Ad—VEGF—HA重組腺病毒感染MSC后6h(MOI=50)，部分細(xì)胞已經(jīng)有熒光顯示，隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光越來(lái)越強(qiáng)。轉(zhuǎn)化率可達(dá)80％。 2.抗HA免疫組化染色示重組MSC細(xì)胞胞漿中有褐色顆粒，表明其有VEGF—HA表達(dá)。 3.隨著重組MSC細(xì)胞的克隆性增殖，其分泌的VEGF也逐漸增多。經(jīng)ELISA法測(cè)定，一周后培養(yǎng)上清中的VEGF分泌量達(dá)平臺(tái)期，第8天時(shí)達(dá)2471ng/mL。據(jù)此，我們選擇培養(yǎng)一周的重組MSC細(xì)胞進(jìn)

10、行移植。 結(jié)論： 成功將Ad—VEGF—HA重組腺病毒轉(zhuǎn)染入MSC內(nèi)，使MSC穩(wěn)定表達(dá)并分泌VEGF。為以后的移植治療做準(zhǔn)備。 第3章 VEGF修飾MSC移植治療促進(jìn)放射性腦微血管內(nèi)皮的新生 研究目的： 建立大鼠RIB模型，將VEGF轉(zhuǎn)基因MSC移植入大鼠腦微血管損傷區(qū)，觀察移植區(qū)內(nèi)皮細(xì)胞密度變化，外源性VEGF分泌以及模型大鼠的行為學(xué)改變。 研究方法： SD大鼠全腦分割照射45

11、Gy，每次5Gy，共9次，3周內(nèi)完成制造RIB模型。A組為單純照射組，B組為轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞移植組，C組為注射單純MSC移植組，D組注射同體積生理鹽水組，E組為未照射組。B組動(dòng)物在最后一次照射完成后第7天，在立體定位儀下，微量注射器向右側(cè)內(nèi)囊區(qū)域注入5μL(1×105個(gè))轉(zhuǎn)染VEGF的MSC細(xì)胞懸液。C組只注射5μL(1×105個(gè))MSC細(xì)胞。治療后各時(shí)間點(diǎn)行冰凍切片觀察治療區(qū)域血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物Ⅷ因子免疫組化熒光標(biāo)記和GFP示蹤蛋白。5個(gè)

12、隨機(jī)高倍視野下Ⅷ因子陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)代表微血管密度(40×，0.13mm2)。Western blotting方法檢測(cè)治療部位VEGF—HA融合蛋白的表達(dá)情況。照射后各時(shí)間點(diǎn)觀察病理切片，EB法測(cè)血腦屏障改變，Morris水迷宮法檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。 結(jié)果： 1.移植后2周，B組治療部位組織病理切片在熒光顯微鏡下可見(jiàn)大量GFP顯示，3周后明顯減少。 2.移植后2周的，B組注射部位區(qū)組織Western blotting

13、檢測(cè)VEGF—HA融合蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射部位有較多VEGF—HA表達(dá)。 3.血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物Ⅷ因子免疫組化顯示，照射后1個(gè)月，與未照射組相比，內(nèi)囊區(qū)內(nèi)皮細(xì)胞密度已經(jīng)出現(xiàn)下降(P<0.01)，照射后3個(gè)月細(xì)胞密度進(jìn)一步下降。照射后1個(gè)月和3個(gè)月B組較A組內(nèi)皮細(xì)胞密度增加(P<0.01)，C組內(nèi)皮細(xì)胞密度較A組有增加(P<0.05)，但少于B組(P<0.05)。 4.組織病理學(xué)顯示各組大鼠治療部位并未出現(xiàn)出血和白

14、質(zhì)壞死等改變。 5.受照后各組EB含量在照射后2周未見(jiàn)升高，照射后1個(gè)月開(kāi)始，EB含量開(kāi)始增加(P<0.05)；3個(gè)月較1個(gè)月時(shí)顯著增加。B組治療組的EB含量較A組單純照射組明顯減少(P<0.01)。 6.學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè)：照射后3個(gè)月和4個(gè)月，照射組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力出現(xiàn)進(jìn)行性下降，B組學(xué)習(xí)記憶能力顯著改善(P<0.01)。C組較A組學(xué)習(xí)記憶能力亦有改善，但改善幅度小于B組(P<0.01)。 結(jié)論： V