中國美利奴羊MHC-DRB1 exon2單倍型構(gòu)建及與布魯氏菌病易感性關(guān)聯(lián)性.pdf

1、目的：通過對中國美利奴羊MHC-DRB1exon2基因多態(tài)性進(jìn)行研究，并構(gòu)建其單倍型，探討該基因SNPs與布魯氏菌病易感性相關(guān)性，初步篩選與布魯氏菌病易感性相關(guān)的單倍型。此研究的目的在于借鑒人類在疾病與HLA-DRB1多態(tài)性關(guān)系的研究中的經(jīng)驗(yàn)，運(yùn)用于OLA-DRB1基因SNPs與綿羊各種疾病的相關(guān)性分析上，這為利用標(biāo)記輔助選擇選育綿羊抗病新品種以及進(jìn)一步研究MH C的抗病機(jī)理打一定前期基礎(chǔ)，為今后開展布魯氏菌抗性分子標(biāo)記輔助選擇研究提供

2、了一定的依據(jù)，為進(jìn)一步定位具有易感性的遺傳位點(diǎn)而最終進(jìn)行抗病育種奠定基礎(chǔ)。
　　方法：⑴運(yùn)用虎紅平板凝集試驗(yàn)對193個中國美利奴羊進(jìn)行綿羊種布魯氏菌陽性血清檢測，然后采用PCR結(jié)合SSCP技術(shù)檢測其MHC-DRB1exon2的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)，而后對不同等位基因進(jìn)行克隆測序，運(yùn)用分子生物學(xué)軟件進(jìn)行比對分析，將檢測到的SNPs及單氨基酸多態(tài)性(SAPs)分別與人及其他不同品種綿羊的SNPs進(jìn)行比較分析，再用SHEsis在線

3、軟件對每個SNP位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率進(jìn)行差異統(tǒng)計(jì)分析，從而分析其與布魯氏菌病易感性的相關(guān)性。⑵采用PCR產(chǎn)物直接測序法對40例布魯氏菌陽性和陰性中國美利奴羊的MHC-DRB1exon2的SNPs進(jìn)行檢測，然后對其進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢測及連鎖不平衡分析，而后運(yùn)用SHEsis在線軟件對篩選的SNPs構(gòu)建單倍型并進(jìn)行單倍型關(guān)聯(lián)分析，初步推測與布魯氏菌病易感性相關(guān)的單倍型。
　　結(jié)果：①虎紅平板凝集試驗(yàn)檢測綿羊

4、種布魯氏菌陽性，在193個中國美利奴羊個體中檢出126個布魯氏菌陰性個體，其余的67個為陽性個體，布魯氏菌陽性檢出率為34.71％。②在中國美利奴羊MHC-DRB1exon2(270bp)的序列內(nèi)共檢測到41個SNPs，其中不存在插入和缺失位點(diǎn)，這些位點(diǎn)中包括9個簡約位點(diǎn)和32個單一多態(tài)位點(diǎn)。對其氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)23個氨基酸多態(tài)位點(diǎn)。③對HLA-DRB1exon2的多態(tài)性進(jìn)行分析，研究發(fā)現(xiàn)55個SNPs和36個SAPs，與中國美

5、利奴羊相比，僅有7個SNPs位點(diǎn)相同，其余均呈現(xiàn)不同，而且單氨基酸多態(tài)性較為豐富。④10個品種綿羊MHC-DRB1exon2的共有片段(270bp)進(jìn)行序列比對分析，結(jié)果表明不同品種綿羊的SNPs位點(diǎn)及SAPs位點(diǎn)不盡相同。⑤在41個SNPs位點(diǎn)中，僅有109 C/T位點(diǎn)的等位基因在病例-對照樣本中的分布存在顯著差異(P<0.05)。針對每個SNP位點(diǎn)的基因型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)每個位點(diǎn)的基因型頻率在病例組和正常對照組中的分布不存在差異性

6、。⑥根據(jù)構(gòu)建單倍型所符合的條件，從檢測的SNPs位點(diǎn)中共篩選出29個符合條件，可用于連鎖不平衡分析和單倍型構(gòu)建。經(jīng)連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)中國美利奴羊MHC-DRB1exon2僅存在9個LD Block，且SNPs兩兩之間存在強(qiáng)連鎖不平衡，將其依次命名為Block1-Block9，但是發(fā)現(xiàn)每個LD Block內(nèi)的SNPs位點(diǎn)數(shù)卻各不相同，Block7包括A171G、G172C、A190G和G200T四個SNPs位點(diǎn)，而Block1、Block

7、3和Block4卻只有兩個SNPs位點(diǎn)組合而成。⑦經(jīng)單倍型分析，發(fā)現(xiàn)中國美利奴羊MHC-DRB1exon2上由篩選的29個SNPs位點(diǎn)，構(gòu)建了9種單倍型，根據(jù)這些單倍型在病例-對照組中的分布差異性，發(fā)現(xiàn)其中只有Hap8和Hap9兩種單倍型在病例和對照組中比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：⑴分析中國美利奴羊MHC-DRB1exon2多態(tài)位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)在270bp內(nèi)共檢測到41個多態(tài)位點(diǎn)，及23個氨基酸多態(tài)位點(diǎn)，充分說明該

8、序列的確存在豐富的SNPs和SAPs，表現(xiàn)為豐富多態(tài)性。⑵由于綿羊與人的MHC-DRB1exon2序列具有高度同源性，因而對 HLA-DRB1exon2的多態(tài)性進(jìn)行分析，研究結(jié)果表明人MHC-DRB1exon2的SNPs和SAPs明顯比中國美利奴羊豐富復(fù)雜。⑶10個品種綿羊的MHC-DRB1exon2共有片段(270bp)進(jìn)行序列比對分析，結(jié)果表明不同品種綿羊的SNPs位點(diǎn)及氨基酸變異位點(diǎn)不盡相同。⑷對中國美利奴羊MHC-DRB1exo

9、n2多態(tài)性與布魯氏菌病易感性的相關(guān)性研究，研究發(fā)現(xiàn)109 C/T可能與綿羊種布魯氏菌病易感性相關(guān)，而每個SNP位點(diǎn)的基因型可能與布魯氏易感性不相關(guān)，結(jié)果證實(shí)了DRB1基因有參與抗原遞呈。⑸由于兩兩之間存在連鎖不平衡，僅發(fā)現(xiàn)9個連鎖不平衡域，而且每個Block中的SNPs兩兩之間存在強(qiáng)連鎖不平衡。構(gòu)建了9種單倍型，根據(jù)這些單倍型在病例-對照組中的分布差異性，發(fā)現(xiàn)其中有兩種單倍型Hap8和Hap9與布魯氏菌病易感性的差異顯著(P<0.05)