人脂肪干細胞生長特性的觀察和一步法凍存細胞的可行性研究.pdf

1、背景：人脂肪干細胞(hADSCs)是Zuk PA等[1]于2001年首次從人抽脂術(shù)中脂肪組織懸液中獲得，以其組織來源豐富、取材方便、創(chuàng)傷小，易體外分離培養(yǎng)、增殖穩(wěn)定，有多向分化潛能等特點[2-5]，為未來科研和臨床提供了廣闊的應(yīng)用前景，成為繼骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)之后又一研究熱點[6]。目前對于hADSCs體外培養(yǎng)生長特性和凍存、復蘇細胞的方法研究較少，極大限制了hADSCs的深入研究和臨床應(yīng)用。
　　 目的：觀察hAD

2、SCs體外培養(yǎng)不同時期的形態(tài)特征與生長特性，并對比探索以-70℃一步法凍存細胞的可行性。進一步認識hADSCs體外培養(yǎng)中的生長規(guī)律和細胞生物學表型特點，優(yōu)化凍存方法，為以hADSCs為種子細胞的臨床干細胞移植研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：于術(shù)中取患者皮下脂肪組織3～5 g，膠原酶消化法體外分離獲取hADSCs，應(yīng)用含20％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培養(yǎng)基行原代及傳代培養(yǎng)。觀察不同傳代時期(P1、P3…P15)細胞形態(tài)特征

3、和生長特性，檢測增殖力(細胞計數(shù)法)，繪制細胞生長曲線，計算群體倍增時間(PTD)。取生長良好的P5細胞，應(yīng)用流式細胞儀，采用“排除法”鑒定細胞表面抗原表達類型。取處指數(shù)生長期P5細胞，利用“10％DMSO+40％FBS+50％DMEM/F12”細胞凍存保護液，分別行-70℃一步法凍存及常規(guī)-70℃凍存，于3d和30d后復蘇細胞。對比-70℃一步法凍存及常規(guī)-70℃凍存后復蘇細胞的活力(臺盼藍拒染法)及培養(yǎng)中的形態(tài)特征和生長特性，檢測復

4、蘇細胞首次傳代培養(yǎng)后的增殖力(MTT比色法)，且與凍存前細胞比較。
　　 結(jié)果：原代培養(yǎng)細胞形態(tài)不一，增殖緩慢；傳代后形態(tài)逐步趨于一致。P1細胞含有部分異型細胞，且增值稍緩慢，PTD約75h；P3后細胞形態(tài)均一，增殖旺盛，PTD約64h；P11后細胞增殖速度迅速減慢，P13后細胞呈現(xiàn)衰老特征，PTD約85h。hADSCs表型鑒定提示：CD29、CD44陽性表達，CD34、CD45、HLA-DR陰性表達，符合間充質(zhì)干細胞表面分子表

5、達特點。-70℃一步法凍存和常規(guī)-70℃凍存3d及30d后復蘇細胞的成活率可達91％左右，復蘇后初種植細胞貼壁時間較凍存前延長并伴有少部分細胞死亡，生長較緩慢，傳代培養(yǎng)后呈現(xiàn)旺盛增殖，細胞形態(tài)和生長特性與凍存前一致。-70℃一步法凍存和常規(guī)-70℃凍存3d及30d后復蘇細胞活力比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；但與凍存前細胞活力比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。-70℃一步法凍存和常規(guī)-70℃凍存后復蘇細胞傳代培養(yǎng)中增殖力比