雞傳染性支氣管炎病毒S1蛋白親和肽特性及相關(guān)受體功能研究.pdf

1、雞傳染性支氣管炎(avian infectious bronchitis，IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(avianinfectious bronchitis virus，IBV)引起的一種急性、高度接觸性呼吸道傳染病。由于IBV變異頻繁，血清型復(fù)雜，所致疾病的臨床表現(xiàn)差異較大，在不同地區(qū)和不同時(shí)間的地方流行毒株總是以各種形式出現(xiàn)，所以對(duì)于IBV的分子生物學(xué)研究和與病毒入侵相關(guān)受體的研究成為一個(gè)重點(diǎn)。IBV纖突糖蛋白(Spike，S)是

2、位于病毒粒子表面的結(jié)構(gòu)蛋白，它既有介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生病毒中和抗體的抗原表位，具有良好的免疫原性，又含有介導(dǎo)病毒侵入宿主細(xì)胞的受體結(jié)合域，是冠狀病毒入侵和繁殖的關(guān)鍵蛋白。
　　1.本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了編碼IBV Beaudette株S1基因的pET-S1原核重組表達(dá)質(zhì)粒，并在E.Coli Rosetta中進(jìn)行了原核表達(dá)，獲得了大小為63 Ku的目的條帶，使用IBV全病毒多抗進(jìn)行Western blot證實(shí)所表達(dá)的蛋白為IBVS1蛋白。

3、　　2.利用噬菌體隨機(jī)十二肽庫(kù)，以IBV S1重組蛋白為靶分子，進(jìn)行了四輪生物淘選。對(duì)第四輪洗脫物進(jìn)行功能鑒定，淘選出10個(gè)噬菌體單克隆進(jìn)行序列測(cè)定，推導(dǎo)多肽序列，結(jié)果表明，最終篩選出三個(gè)可以與IBV S1蛋白特異性結(jié)合的噬菌體，推導(dǎo)氨基酸序列為L(zhǎng)WAQAKSLHTLA，MYSPRPPALSTV，HWDPFSLSAYFP，分別命名為L(zhǎng)，M，H多肽，ELISA實(shí)驗(yàn)證明H多肽可以和S1蛋白特異性的結(jié)合，并且可以和gAPN蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合S1蛋白

4、，同時(shí)H多肽可以和gAPN的多克隆抗體結(jié)合，證明所篩選出的多肽H可以模擬gAPN的抗原表位，gAPN可能作為IBV的受體和IBV的S1蛋白結(jié)合。病毒體外抑制實(shí)驗(yàn)表明所篩選出來(lái)的多肽H具有良好的抗病毒活性，可以有效的抑制IBV感染Vero細(xì)胞，當(dāng)多肽的濃度為500μg/mL時(shí)，抑制率最大為59.6％。
　　3.利用篩選得到的噬菌體，建立了IBV的噬菌體介導(dǎo)ELISA檢測(cè)方法，該方法可以有效的檢測(cè)到IBV抗原，檢測(cè)的最低病毒量為1.2

5、1×105 copeis/μL，并具有較高的特異性，同時(shí)將所建立的ELISA方法與RT-PCR法和Real-Time PCR進(jìn)行了比較，檢測(cè)的敏感性依次為Real-Time PCR，RT-PCR法和噬菌體ELISA法。
　　4.用FITC標(biāo)記的H多肽進(jìn)行免疫熒光，在Vero細(xì)胞和CEK細(xì)胞上證明了所合成的FITC標(biāo)記的多肽可以有效的與IBV結(jié)合，并對(duì)雞在感染IBV M41后體內(nèi)病毒的分布進(jìn)行了研究，證實(shí)了在氣管、肺臟和腎臟均能有效

6、的檢測(cè)到病毒的分布，在感染后第1d即可在氣管內(nèi)檢測(cè)到病毒，第3d可以在肺臟和腎臟中檢測(cè)到IBV，氣管持續(xù)到17d，肺臟持續(xù)到7d，腎臟持續(xù)到10d，兔抗IBV多抗的檢測(cè)結(jié)果是氣管2～10d，肺臟2～6d，腎臟2～7d，證明標(biāo)記多肽的效果優(yōu)于多克隆抗體，具有成本低，特異性好，操作方便的優(yōu)勢(shì)。
　　5.克隆了雞氨基肽酶N(gAPN)基因全長(zhǎng)共2906bp，構(gòu)建了pET-gAPN原核重組表達(dá)質(zhì)粒，并在EColi Rosetta中進(jìn)行原核

7、表達(dá)，得到了大小為113Ku的目的條帶。以純化的gAPN重組蛋白為免疫原制備了多克隆抗體。利用Western blot及間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明此多克隆抗體具有良好的生物學(xué)活性，可以與原核表達(dá)的蛋白和天然的gAPN蛋白產(chǎn)生特異性的條帶和熒光。Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)了原核表達(dá)的gAPN蛋白可以和IBV結(jié)合，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明gAPN蛋白抗體能沉淀到S1蛋白，為證明gAPN是IBV的功能受體奠定了基礎(chǔ)，利用gAPN多克隆抗體在CEK細(xì)

8、胞進(jìn)行病毒阻斷實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了gAPN抗體可以阻斷病毒感染CEK細(xì)胞，gAPN血清稀釋度為2-1時(shí)阻斷率最高，阻斷率為81.14％。
　　6.構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-gAPN，將其轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞，用IBV Beaudette株進(jìn)行感染，RT-PCR，Real-Time PCR和間接免疫熒光均檢測(cè)到了IBV的增殖，并繪制了病毒增殖曲線(xiàn)，證明IBV Beaudette株可以感染轉(zhuǎn)染gAPN的Hela細(xì)胞，并產(chǎn)生感染性病毒粒子。免

9、疫熒光共定位和激光共聚焦證明了gAPN可以介導(dǎo)IBV感染細(xì)胞，gAPN的熒光位于細(xì)胞膜，病毒的熒光位于細(xì)胞漿內(nèi)。用不同的IBV毒株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了不同的IBV毒株H120，W93，M41，HH12均能感染轉(zhuǎn)染了gAPN的Hela細(xì)胞，證實(shí)了實(shí)驗(yàn)的可靠性，分別在轉(zhuǎn)染gAPN之后的12和24h感染IBV Beaudette株，在接毒后12h、18h、24h、36h、48h測(cè)定病毒的滴度，證實(shí)了少量的gAPN即可介導(dǎo)病毒的感染，感染量與gAP