“調(diào)肝腎、祛痰瘀”治法方藥逆轉(zhuǎn)SHR血管重構(gòu)的作用機理研究.pdf

1、第一部分理論探討: 一、血管重構(gòu)與原發(fā)性高血壓 血管對血壓始終都發(fā)揮著自身的重要調(diào)節(jié)作用。它能產(chǎn)生許多活性物質(zhì)，調(diào)節(jié)血管的結(jié)構(gòu)和功能。因此，血管本身障礙及如何糾正這一障礙是高血壓發(fā)病機制及其防治中的一個重要問題，而其關(guān)鍵又是糾正血管平滑肌細胞(Vascular Smooth Muscle Cell，VSMC)結(jié)構(gòu)和功能的改變。 與高血壓伴隨的血管結(jié)構(gòu)和功能的變化，即是血管重構(gòu) (Vascular Remodeli

2、ng，VR)主要包括：①血管壁增厚，尤其是中層肥厚，導(dǎo)致壁與腔之間的比例明顯加大，血流阻力和血管對縮血管物質(zhì)的反應(yīng)性增強；②阻力血管變得稀少，尤其是直徑12-25μm 的阻力血管數(shù)目明顯減少，隨之產(chǎn)生一系列血管功能異常。許多研究證實：高血壓阻力血管結(jié)構(gòu)變化與 VSMC 增生和肥大有關(guān)。VSMC 結(jié)構(gòu)的變化及血管壁肥厚在不同類型的高血壓表現(xiàn)都較為相似，即通過 VSMC 生長和血管壁“重塑”共同作用的結(jié)果。 高血壓時VSMC 通過自

3、分泌、旁分泌和細胞內(nèi)分泌等多種方式分泌多種生物活性物質(zhì)調(diào)節(jié)自身生長，如血小板源生長因子(Platelet-derived growth factor，PDGF)和轉(zhuǎn)移生長因子—β<,1>(transforming growth factor β<,1>，TGF-β<,1>)，這在高血壓血管肥厚的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。大量實驗證明鈣，尤其是VSMC內(nèi)游離Ca<'2+>，在維持細胞正常功能和許多心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中具有十分重要的作用。血

4、管平滑肌細胞內(nèi)游離鈣的增多，被認為是原發(fā)性高血壓發(fā)生機制的最后共同途徑。當(dāng)細胞內(nèi)CaCa<'2+>濃度升高后，CaCa<'2+>與其細胞內(nèi)受體鈣調(diào)素 (Calmodin，CaM)結(jié)合生成復(fù)合物，后者通過一系列磷酸化過程引起平滑肌細胞收縮，并可促進多種癌基因的表達，如 c-fos、c-myc、c-myb 等，從而引起血管平滑肌肌細胞的增殖和肥厚。 二、逆轉(zhuǎn)血管重構(gòu)的研究意義及研究概況 血管重構(gòu)與高血壓、動脈粥樣硬化和冠心病

5、等多種心血管的疾病的發(fā)病有密切的關(guān)系，可加速疾病的進程。盡管目前血管重構(gòu)的機制尚未完全明確，但其有關(guān)機制以及逆轉(zhuǎn)心血管重構(gòu)的研究已成為研究的熱點。 目前大多數(shù)合成藥物往往由于副作用，或是由于聯(lián)合用藥時的拮抗作用，或是由于長期用藥所帶來的經(jīng)濟負擔(dān)，仍然處于不斷研究探索當(dāng)中；而中藥復(fù)方所表現(xiàn)出的整體調(diào)節(jié)作用，避免了化學(xué)藥物針對單一的病理環(huán)節(jié)，從而顯示出良好的應(yīng)用開發(fā)前景。本課題組長期以來一直從事中醫(yī)“調(diào)肝腎，祛痰瘀”治法方藥防治高血

6、壓及其并發(fā)癥的研究，我們既往的研究工作表明“調(diào)肝腎，祛痰瘀”治法方藥對高血壓病具有良好的整體調(diào)節(jié)作用。 第二部分實驗研究: 一、材料和方法 (一)藥物調(diào)肝腎、祛痰瘀中藥復(fù)方 (簡稱“調(diào)方”)，其組成為：熟地 25g、龜版 30g (打碎、先煎)、丹參15g、三七5g、鉤藤15g (后下)、全瓜萎 15g、懷牛膝 15g。所用中藥均由本校第一附屬醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)藥劑科鑒定為純正藥材。常規(guī)煎煮取汁后濃縮至含生藥1.

7、06g/ml。藥液常溫冷卻后，置 4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?(二)動物分組及給藥1、整體療效學(xué)研究親代自發(fā)性高血壓大鼠 (Spontaneously Hypertensive Rat，SHR)由北京維通利華實驗動物有限公司提供，合格證號為 0048303，12 周齡，清潔級，其中雄性17只，體重250±25g，雌性34只，體重 160±25g。SHR 按體重及雄、雌1：2 的比例隨機分為4組。在測定尾動脈收縮壓后同籠配對繁育，每籠1

8、雄2雌，每組4籠。 從6周起觀察血壓測量值；至12周取材，觀察血管中膜厚度及與管腔比值、細胞的超微結(jié)構(gòu)。 2、離體培養(yǎng)VSMC重構(gòu)機制探討 SHR VSMC 原代培養(yǎng)采用貼塊法，常規(guī)方法制備調(diào)方含藥血清及正常對照血清，噻唑藍(MTT)染色法篩選適合VSMC生長的調(diào)方含藥血清濃度，從鈣系統(tǒng)、PDGF—A、TGF—β<,1>角度探討調(diào)方逆轉(zhuǎn)血管重構(gòu)的機制。 二、結(jié)果: (一)調(diào)肝腎、祛痰瘀復(fù)方發(fā)病前不

9、同時段給藥逆轉(zhuǎn)SHR血管重構(gòu)的整體療效學(xué)影響 本文采用SHR模型研究高血壓血管重構(gòu)的變化，揭示高血壓和血管重構(gòu)在發(fā)病前不同時段的關(guān)系，由實驗的結(jié)果可以看出調(diào)肝腎、祛痰瘀治法及其組方于發(fā)病前和(或)發(fā)病早期實施干預(yù)，能有效地延緩SHR早期的血壓上升，在6周齡后顯示出明顯的控制血壓上升的效果；第6周時S1—4和S1—10組的血壓低于另兩組，提示“釀乳”這一間接給藥方式的效應(yīng)，其藥代動力學(xué)有待進一步研究。通過細胞形態(tài)計量分析發(fā)現(xiàn)，S1

10、—10組對于改善VSM中膜層厚度和內(nèi)膜損傷與S空白組比較有非常顯著性差異，S1—4 對于改善VSM中膜層厚度與S空白組比較有顯著性差異，而S5—10與S空白組比較無顯著性差異。而且，VSMC 有超微結(jié)果損害，突出表現(xiàn)為胞質(zhì)內(nèi)線粒體密度不均勻，形態(tài)腫脹，嵴結(jié)構(gòu)紊亂或消失，線粒體是細胞內(nèi)的重要鈣離子庫，這種改變提示細胞內(nèi)鈣代謝失調(diào)可能是高血壓的細胞損害的重要機制。提示調(diào)方具有良好的逆轉(zhuǎn)SHR血管重構(gòu)的作用，早期干預(yù)(1—4周)對于血管平滑肌

11、中膜的形成、生長可能有決定性意義。 (二)調(diào)肝腎、祛痰瘀復(fù)方含藥血清對 VSMC 內(nèi)鈣系統(tǒng)的影響 本實驗觀察到，各組大鼠血管平滑肌鈣離子水平、鈣調(diào)素水平的變化成時段依賴性，第10周和第12 周取材的 VSMC 內(nèi)游離[ca<'2+>]i較第1周和第5周取材組明顯增高，可能與血管活性物質(zhì)和生長因子可能促進細胞膜鈣離子通道的開放增加了細胞對鈣的攝取有關(guān)；第1周和第5 周取材組[Ca<'2+>]i與S12比較有非常顯著性差異；

12、使用含藥血清后，各中藥血清組[Ca<'2+>]i 均較正常血清組低，雖無統(tǒng)計學(xué)意義，但提示調(diào)方含藥血清有降低胞內(nèi)游離鈣濃度的趨勢，使VSMC增殖肥大作用明顯減弱，與實驗三的結(jié)果相結(jié)合來看，可能與具有拮抗生長因子促進細胞膜鈣離子通道主動轉(zhuǎn)運鈣的作用有關(guān)。各組 VSMC Ca<'2+>-ATP 活性變化成時段依賴性，即S1>S5>S10>S12，S1、S5、10中藥血清組VSMC Ca<'2+>-ATP活性與S12比較有非常顯著性差異，提示

13、Ca<'2+>-ATP活性隨高血壓的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系；使用含藥血清后，各中藥血清組VSMC Ca<'2><'+>-ATP 活性均較正常血清組高，提示調(diào)方含藥血清可上調(diào) VSMC Ca<'2+>-ATP活性，其機制可能與降低胞內(nèi)高Ca<'2+>濃度可以進一步上調(diào)Ca<'2+>活性有關(guān)。 (三)調(diào)肝腎、祛痰瘀復(fù)方對VSMC內(nèi)PDGF-A、TGF-β<,1>的影響 本研究發(fā)現(xiàn)：PDGF-A 鏈和TGF-β<,1>表達在S1

14、2，S10<,空>和S5，S1 具有顯著差異，S12＞S10<,空>＞S10<,藥>＞S5<,空>＞S5<,藥>＞S1，在S1各組中PDGF-A和TGF—β<,1>鏈幾乎無表達，S5 各組中僅有微量表達，而在S10 兩組中比較，含藥血清組的表達又少于空白組，S10<,空>與S12的表達量差異不明顯。這一結(jié)果提示：①這種自身PDGF—A鏈和TGF—β<,1>的高表達，可能在自發(fā)性高血壓大鼠血管平滑肌細胞增殖肥大、血管功能異常中具有重要作用

15、。②含藥血清不同時段給藥對PDGF—A鏈和TGF—β<,1>表達的抑制作用不同，提示早期干預(yù)有重要意義。 第三部分研究結(jié)論: 一、研究顯示，調(diào)肝腎、祛痰瘀治法及其方藥在高血壓發(fā)病前不同時段給藥，有確切的延緩血壓上升的作用，而且作用效果平穩(wěn)、持久、緩和，以全程給藥組作用最佳，從而部分揭示了這一臨床組方思路的可行性與合理性。 二、調(diào)方能改善VSM中膜厚度和VSMC 超微結(jié)構(gòu)，提示調(diào)方能逆轉(zhuǎn)高血壓血管重構(gòu)現(xiàn)象，具有一定