HBcAg18-27V-I變異體對慢性乙型肝炎患者外周血HLA-A2限制性T淋巴細胞功能的影響.pdf

1、研究背景： 慢性HBV感染一直是危害全球人民健康的主要致病因素之一。近年來，有關(guān)其發(fā)病機制取得了多方面的進展，同時也進一步暴露出若干重要問題需要加以深入研究。由于HBv感染的宿主譜較窄，且缺乏穩(wěn)定的體外感染的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，因此束縛了其致病機制的研究。一般情況下，HBV本身并不直接導(dǎo)致肝細胞損害，而大量淋巴細胞浸潤肝臟提示T細胞免疫與慢性乙型肝炎(CHB)肝細胞的損傷密切相關(guān)。特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)應(yīng)答是機體清除肝細胞

2、內(nèi)HBV感染的主要機制之一。HBV在體內(nèi)清除的機制涉及諸多方面的重要因素，包括宿主的免疫遺傳學(xué)背景、感染的HBV病毒學(xué)背景等；而體內(nèi)特異性CTL的種類及活化程度則是這兩方面的交叉和綜合體現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎病毒(HBV)特異性T淋巴細胞表位(epitope)，是特異性細胞免疫應(yīng)答得以激發(fā)的重要原動力，處于免疫識別和免疫激活的核心位置。HLA-A&0201限制性HBV特異性CTL表位HBcAgl8-27(FLPSDFFPSV，簡記為C1

3、8-27V)被認為是HBV CTL表位研究中的最為經(jīng)典的序列，是目前被引用最多的HBV表位肽，并常在乙型肝炎細胞免疫學(xué)研究中作為慢性感染的陽性參照。然而，在C18-27V的引用過程中，研究者多忽略了對該表位分子病毒學(xué)和分子免疫學(xué)背景的辨析。因此，研究我國HBV慢性感染患者中HLA-A四種主流等位基因A11、A2、A24和A33的分布，了解我國流行的HBV基因型B和C型毒株HBcAg18-27V/I變異體的分布差異，探討不同HLA-A2+

4、慢性乙型肝炎患者外周血CD8+T淋巴細胞的結(jié)合頻數(shù)，明確HBcAg18-27V/I變異體對慢性乙型肝炎患者外周血T淋巴細胞頻數(shù)和功能狀態(tài)的影響，可以為HBV CTL新表位的篩選提供更符合中國HBV病毒學(xué)和免疫學(xué)背景的陽性表位對照。 研究目的： 1．通過了解我國華南地區(qū)慢性乙型肝炎患者主流HLA-A等位基因的分布特征，特別是HLA-A2、A11、A24、33在慢性乙型肝炎患者中的分布狀況，為篩選中國不同HBV基因型HLA-

5、A11、A33限制性CTL新表位提供重要的宿主遺傳學(xué)背景，也是表位篩選研究的前提基礎(chǔ)。 2．通過了解我國不同地區(qū)HBV感染者不同基因型之間存在的HBcAg18-27V/I變異體的分布差別，與歐美等地區(qū)的HBV基因型發(fā)現(xiàn)的HLA-A2限制性表位HBcAg18-27V進行分子流行病學(xué)的對比，為中國HBV感染人群的CTL新表位篩選提供必要的病毒學(xué)背景，闡明病毒學(xué)差異對免疫學(xué)差異的影響，避免片面分析可能引起的謬誤。 3．通過比較

6、18-27 V和18-27 I對HLA-A2分子的結(jié)合能力和誘導(dǎo)免疫應(yīng)答能力的差異，了解HBcAg18-27V/I變異體與慢性乙型肝炎患者外周血中特異性淋巴細胞頻數(shù)及功能的關(guān)系，為CTL新表位的篩選提供更符合中國國情的HBV病毒學(xué)和免疫學(xué)背景的陽性表位對照。 研究方法： 1．以267例慢性乙型肝炎患者和300例健康獻血員為研究對象，用離心柱型血液基因組DNA抽提試劑盒進行外周血染色體基因組DNA的提取，合成序列特異性的H

7、LA-A11、A2、A24、A33引物，并以β-actin的基因擴增產(chǎn)物作為內(nèi)參照物，運用序列特異性引物-聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR-SSP)法進行HLA-A11、A2、A24、A33等位基因檢測型，應(yīng)用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析?；蝾l率的計算采用直接計數(shù)法；組間對應(yīng)等位基因頻率的比較采用x<'2>檢驗，以P<0.05為有顯著性意義。 2．應(yīng)用分子生物學(xué)和生物信息學(xué)方法運用PCR擴增本室保存的中國8省市HBV基因型調(diào)查血清

8、，每個地區(qū)選擇血清20份，共160份。分析不同地區(qū)、不同HBV基因型、不同臨床結(jié)局HBV感染者血清中HBV/C基因片段，測序分析HBcAg18-27特異性CTL表位堿基水平和氨基酸水平變異的情況；運用表位預(yù)測網(wǎng)站分析不同HBcAg18-27特異性CTL表位基因變構(gòu)體與HLA-A2.1分子之間親合力的影響。 3．收集ALT≥2×ULN的慢性乙肝患者外周血淋巴細胞，通過PCR-RFLP法分析感染者的HBV基因型、HBcAg18-27

9、V/I，PCR-SSP法分析HLA-A2基因型，應(yīng)用以PE標記的四聚體(Tetramer)和FITC標記的CD8單克隆抗體雙重標記淋巴細胞，用流式細胞儀分別檢測HBcAg18-27V-Tetramer(+)/CD8(+)和HBcAg18-271-Tetramer(+)/CD8(+)的淋巴細胞數(shù)。18.27V/I特異性T細胞的陽性率比較應(yīng)用配對t檢驗，組間比較應(yīng)用獨立樣本t檢驗，P<0.05為有顯著性意義。 研究結(jié)果： 1

10、．慢性乙型肝炎(CHB)組HLA-A11、A2、A24、A33的基因頻率分別為57％、41％、21％、7％，以HLA-A11最常見。健康對照組四種HLA-A等位基因的頻率分別為57％、46％、24％、14％，也以HLA-A11最常見。HLA-A33的頻率在兩組間有顯著差異(X<'2>=7.556，P=0.006)。CHB組HLA-A2/A11、A2/A24、A2/A33、A11/A24、A11/A33、A24/A33的基因頻率分別為17

11、％、4％、1％、16％、4％、0.4％，健康人群則為18％、8％、4％、11％、5％、1％，各種基因組合的出現(xiàn)率在兩組間近似。HBeAg(+)與HBeAg(-)CHB組比較，HLA-A11(X<'2>=3.324，P=0.072)、A2(X<'2>=0.324，P=0.569)、A24(X<'2>=0.308，P=0.579)、A33(X<'2>=1.159，P=0.282)等位基因的頻率分布在兩組間無顯著性差異。 2．我國北京

12、、福建、廣東、海南、湖南、山東、蘭州、云南8省市HBV B、C基因型血清各80份，共發(fā)現(xiàn)HBcAg18-27V 3份，其余均為HBcAg18-27I。C18-27V在B基因型中為2.50％，在C基因型中為1.25％；C18-27I在B基因型中為97.50％，在C基因型中為98.75％。C18.27I占總調(diào)查樣本的98.12％，而C18-27V僅占總調(diào)查樣本的1.88％?？梢?，我國B、C基因型的V/I變異體均以C18-27I為主，兩種表位

13、變異體的構(gòu)成比在基因型間并無顯著差異(X<'2>=0.340，P=0.560)。在108例慢性活動性乙型肝炎患者血清中，B、C基因型各為54例，其中C型中有1例為C18-27V，其余為C18-27I；雖然兩種基因型中C18-27V與C18-27I的分布率比較無顯著差異(X<'2>=1.009，P=0.315)，但C18-27I的出現(xiàn)頻率均顯著高于C18-27V。e抗原陽性的標本中，B、C型分別為57和55例，C18-27V的例數(shù)分別為2

14、和1例，兩種基因型中C18-27V與C18-27I的構(gòu)成比雖無顯著差異(X<'2>=0.307，P=0.580)，但均以C18-27I為占絕對多數(shù)。 3．廣東地區(qū)慢性乙肝患者主要為HLA-A2基因型(2-2/44)；感染的HBV主要為B基因型(35/44)；其中HBcAg18-27為Ⅰ變異體的占優(yōu)勢(43/44)。在43例C18-27I中，A2陽性組HBcAg18-27I-Tetramer(+)/CD8(+)的淋巴細胞頻數(shù)比較H

15、BeAg18-27V-Tetramer(+)/CD8(+)的淋巴細胞頻數(shù)(0.52±0.31 VS 0.13±0.08)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-6.914，P=0.000)。 研究結(jié)論： 1．中國華南地區(qū)CHB患者的主要HLA-A等位基因均為HLA-A11、A2、A24及A33，以HLA-A11最為多見，這健康人群四種主流HLA-A等位基因的分布頻率近似，提示鑒定HLA-A11限制性HBV特異性CTL新表位具有十分重要

16、的意義。此四種等位基因及其組合模式與CHB患者的HBeAg狀態(tài)無明顯相關(guān)，但與HBV感染的其他臨床特點及抗病毒治療應(yīng)答之間的關(guān)系有待研究。 2．我國HBV感染株中HBcAg18-27表位主要為HBcAg18-27I，與歐美地區(qū)鑒定的經(jīng)典HLA-A*0201限制性HBV特異性CTL表位HBcAg18-27V具有極為顯著的分布差異。這一病毒學(xué)背景可能影響我國HBV感染者的特異性細胞免疫應(yīng)答的強度，并可能與抗病毒治療(特別是免疫調(diào)節(jié)治