大鼠肝星狀細(xì)胞分離鑒定及缺氧對肝星狀細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-2表達(dá)及活性調(diào)節(jié)研究.pdf

1、全文分為二部分： 第一部分： 大鼠肝星狀細(xì)胞的分離培養(yǎng)鑒定。 目的：為深入探討肝纖維化的細(xì)胞機(jī)制，探索經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定的肝星狀細(xì)胞分離和培養(yǎng)方法。 方法：采用SD雄性，成年大鼠，450～500g，用1％的戊巴比妥鈉，40mg/kg劑量，腹腔麻醉，皮毛酒精消毒，開腹游離肝門靜脈，插管。用酶I(0.05％Ⅳ型膠原酶、0.1％Pronase E)原位灌流大鼠肝臟，酶Ⅱ(0.1％Ⅳ型膠原酶、0.04％Pronase E、0.0

2、05％DNAase I)消化剪碎的肝組織，兩次低速離心去除肝細(xì)胞，用18％的Nycodenz密度梯離心純化肝星狀細(xì)胞。臺盼藍(lán)試驗(yàn)測存活率，應(yīng)用免疫熒光檢測Desmin在細(xì)胞中的表達(dá)，鑒定肝星狀細(xì)胞純度。 結(jié)果：剛分離的肝星狀細(xì)胞為圓形，10p,m大小，胞漿內(nèi)充滿折光脂滴，肝星細(xì)胞的得率為1×10<'7>～3×10<'7>/肝，存活率為95％。約90％肝星狀細(xì)胞.Desmin表達(dá)陽性。 結(jié)論：原位灌流法是一種有效的大鼠肝星

3、狀細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法。 第二部分： 缺氧調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶及其活性水平機(jī)制的研究。 目的：用氯化鈷(CoCl<,2>)干預(yù)肝星狀細(xì)胞復(fù)制缺氧模型，探討缺氧對肝星狀細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-2(Matrix Metalloproteinase 2，MMP-2)表達(dá)、活性的影響和調(diào)節(jié)機(jī)理，為肝纖維化防治尋找一個新的切入點(diǎn)。 方法：體外培養(yǎng)HSC-T<,6>細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測HSC-T<,6>細(xì)胞α-sMA，

4、desmin表達(dá)。用不同濃度的CoCl<,2>(0μM，50μM，100μM，200μM)，分三個時間點(diǎn)(6h，12h，24h)造成HSC-T<,6>細(xì)胞缺氧，RT-PCR，酶圖法分別檢測MMP-2 mRNA表達(dá)及其酶活性；Western-blotting檢測缺氧誘導(dǎo)因子-1 Q(Hypoxia.mducible factor-1 α，HIF-1 α)表達(dá)；電泳遷移率變動分析(EMSA)檢測HIF-1 α對MMP-2基因的調(diào)節(jié)作用。

5、 結(jié)果：免疫細(xì)胞化學(xué)檢測顯示：HSC-T<,6>細(xì)胞胞漿顯棕黃色，α-sMA和desmin陽性。Hsc-T<,6>缺氧誘導(dǎo)后：RT-PCR檢測顯示：隨CoCl<,2>濃度的遞增缺氧加重，MMP-2基因表達(dá)上調(diào)，同時間點(diǎn)不同濃度比較，均有顯著性差異(F=37．850，P<0.001)；不同時間點(diǎn)之間比較，均有顯著性差異(F=7．503，P<0.003)。明膠酶圖法檢測顯示：6h組，HSC-T<,6>隨CoCl<,2>濃度的遞增缺氧加重

6、，MMP-2的活性逐漸下降，各濃度之間比較之間有顯著性差異(F=29．54，P<0.01)；Western．blotting檢測顯示：6h組，HSC-T<,6>隨COCl<,2>濃度的遞增缺氧加重，HIF-1 α表達(dá)呈劑量依賴性增加，當(dāng)CoCl<,2>濃度達(dá)到250μM HIF-1 α表達(dá)量達(dá)到最大，細(xì)胞死亡量顯著增加：EMSA檢測顯示：核蛋白提取物與MMP-2基因探針(含缺氧反應(yīng)元件)共浴后，電泳遷移條帶產(chǎn)生延遲現(xiàn)象，競爭性序列能部分