基于microRNA表達(dá)譜的偽狂犬病毒及其基因缺失株與PK-15細(xì)胞互作的研究.pdf

1、偽狂犬病毒(PRV)屬于α皰疹病毒，嚴(yán)重危害豬，每年給養(yǎng)殖業(yè)帶來重大的經(jīng)濟(jì)損失。gE是PRV的重要毒力基因，與gI形成的功能復(fù)合體對病毒在細(xì)胞間擴(kuò)散和對神經(jīng)系統(tǒng)的侵染有重要作用。目前gE基因缺失疫苗被廣泛用于PRV的防控，結(jié)合抗體檢測，作為標(biāo)記基因的gE基因也可以用來區(qū)分疫苗接種豬和野毒感染豬。MicroRNA(簡寫miRNA)是長度約20-24nt的單鏈小RNA分子，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平。大量研究證明，病毒和宿主都可以利用miRN

2、A調(diào)節(jié)自身與對方的轉(zhuǎn)錄物，來實現(xiàn)免疫逃避和自我保護(hù)。病毒侵染可導(dǎo)致宿主miRNA表達(dá)譜發(fā)生變化，可以為其生存創(chuàng)造有利條件，同時宿主也可以利用miRNA來實現(xiàn)免疫清除。本研究將PRV及PRV-gEgI分別接種豬腎傳代細(xì)胞系(PK-15)，24h后分別提取總的RNA，通過solexa測序技術(shù)并結(jié)合生物信息學(xué)方法，對兩株病毒侵染PK-15細(xì)胞前后的miRNA表達(dá)譜進(jìn)行深入的分析。
　　高通量測序結(jié)果顯示，在PRV感染后與PRV-gEgI

3、感染后以及未感染的PK-15細(xì)胞中分別檢測到了miRBase19.0數(shù)據(jù)庫豬源成熟miRNA中的218個、221個、225個。除已知的miRNA外，3個樣本還分別鑒定出大量新的豬源miRNA以及5個新的病毒miRNA。通過qRT-PCR驗證隨機(jī)篩選出的12個miRNA，發(fā)現(xiàn)與高通量測序結(jié)果變化趨勢相一致，表明測序結(jié)果真實可信，可用于后續(xù)差異分析。與未感染的PK-15細(xì)胞相比較，PRV感染與PRV-gEgI感染后的PK-15細(xì)胞中均鑒定出

4、差異顯著的miRNA，分別為137個和135個，從中各自篩選出9個差異突出的miRNA并整合TargetScan和miRanda兩個數(shù)據(jù)庫的算法，預(yù)測它們的靶基因，構(gòu)建miRNA-target調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。其中下調(diào)的ssc-miR-24-3p調(diào)控的靶基因最多，ssc-miR-30a-5p與ssc-miR-30d在PRV感染組調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中處于核心位置，ssc-miR-10a-5p與ssc-miR-10b在PRV-gEgI感染組調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中處于核

5、心位置，影響這整個網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性。PRV-gEgI感染組相對于PRV感染組有85個（60個上調(diào)，25個下調(diào)）差異顯著的miRNA，表明基因缺失對細(xì)胞miRNA的表達(dá)有不同影響。
　　為了了解病毒侵染后細(xì)胞異常表達(dá)的miRNA對病毒的作用，本研究隨機(jī)選取了ssc-miR-34a、ssc-miR-16、ssc-miR-145-5p和ssc-miR-499-5p，將它們分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞后接毒，在12和36h時分別收毒。通過熒光定量檢測結(jié)果顯示