移植B7-H4基因修飾胰島細(xì)胞對小鼠I型糖尿病的治療作用及其機(jī)制研究.pdf

1、B7-H4(B7x,B7S1)是最近發(fā)現(xiàn)的B7家族新成員,屬一類共抑制分子,具有抑制T細(xì)胞活化的功能。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建B7-H4真核熒光表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染小鼠胰島細(xì)胞系NIT-1,將B7-H4基因修飾的NIT細(xì)胞(命名為B7-H4-NIT)過繼輸入STZ(鏈脲佐菌素)誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠I型糖尿病模型,觀察對實(shí)驗(yàn)性I型糖尿病的影響,并探討其作用機(jī)制。
　　目的:
　　本研究可望進(jìn)一步闡明I型糖尿病的發(fā)病機(jī)制,并為臨床應(yīng)用胰島細(xì)胞移

2、植治療I型糖尿病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　一、小鼠B7-H4及人IgG Fc基因克隆及真核表達(dá)質(zhì)粒pmB7-H4-Ig及pmB7-H4-GFP的構(gòu)建與鑒定
　　分別從小鼠脾臟和人外周血單個(gè)核細(xì)胞中提取總RNA,借助RT-PCR技術(shù)獲取編碼小鼠B7-H4胞外段(B7-H4ext)和人IgG Fc的cDNA,分別將其克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1,重組為pcDNA3.1-B7-H4ext-IgG Fc。經(jīng)酶切鑒定

3、及測序分析證實(shí),所克隆和構(gòu)建的小鼠B7-H4ext-IgG Fc cDNA閱讀框及連接部位序列正確,表明已成功構(gòu)建可溶性B7-H4胞外段與人IgG Fc融合基因(B7-H4Ig)的重組真核表達(dá)質(zhì)粒。
　　擴(kuò)增小鼠B7-H4(mB7-H4)cDNA全長,將其克隆入真核表達(dá)載體pEGFP-N1,構(gòu)建表達(dá)跨膜型mB7-H4-GFP融合蛋白的真核表達(dá)載體pmB7-H4-GFP。
　　二、轉(zhuǎn)染細(xì)胞
　　按照Lipofectami

4、neTM2000說明書進(jìn)行操作:將pmB7-H4-Ig及pmB7-H4-GFP分別轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞和293T細(xì)胞;將表達(dá)載體pB7-H4-GFP及空載體分別轉(zhuǎn)染NIT細(xì)胞,72小時(shí)后加G418篩選。
　　三、測定B7-H4-GFP融合基因修飾的NIT胰島素分泌水平
　　采用胰島素刺激釋放實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染pB7-H4-GFP及空載體前后NIT細(xì)胞胰島素分泌水平,分析轉(zhuǎn)染B7-H4-GFP融合基因?qū)IT分泌胰島素的影響。
　

5、　四、細(xì)胞增殖反應(yīng)
　　細(xì)胞過繼第1天和第8天上午8點(diǎn)分別取5×106個(gè)EGFP-NIT或B7-H4-NIT細(xì)胞注入受者小鼠腹腔,第14天收集脾細(xì)胞進(jìn)行單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。
　　方法為:取C57BL/6小鼠脾細(xì)胞,加入5μM CFSE,37℃培養(yǎng)10分鐘,加入冷的1640完全培養(yǎng)基終止標(biāo)記,作為反應(yīng)細(xì)胞。EGFP-NIT或B7-H4-NIT為刺激細(xì)胞,作用前37℃下加入30μg/ml絲裂霉素培養(yǎng)2至3小時(shí),以受者小鼠脾細(xì)胞

6、為反應(yīng)細(xì)胞,分別取1×106個(gè)反應(yīng)細(xì)胞和刺激細(xì)胞加樣至96孔培養(yǎng)板進(jìn)行反應(yīng)。37℃,5％CO2條件下與刺激細(xì)胞培養(yǎng)5天后上流式細(xì)胞儀檢測。
　　五、STZ誘導(dǎo)糖尿病模型的建立
　　采用大劑量一次注射方法:C57BL/6小鼠(20只),雄性,隨機(jī)分為模型組(15只)和對照組(5只),禁食、禁水24小時(shí)后一次性腹腔注射STZ(180mg/kg),然后恢復(fù)正常飲食。尾靜脈采血,動(dòng)態(tài)監(jiān)測血糖水平,連續(xù)3天血糖超過11.3mmol/L

7、即視為造模成功,隨后在實(shí)驗(yàn)過程中隔天檢測1次血糖。
　　六、NIT-1細(xì)胞移植
　　洗滌轉(zhuǎn)染空載體和B7-H4基因的NIT-1細(xì)胞(1.5×106),去除培養(yǎng)液中血清和其他成分,懸于0.5m1的PBS中,植入糖尿病模型C57BL/6小鼠腎包膜。每組15只小鼠,移植后每隔1天監(jiān)測1次血糖、體重、生存時(shí)間。受者小鼠血糖水平≤8.4mmol/L被視為恢復(fù)正常,血糖持續(xù)3天高于11.1mmol/L被視為NIT-1細(xì)胞已被排斥。所有樣

8、本均進(jìn)行復(fù)管檢測,同一份樣本兩次結(jié)果的變異率小于5%。
　　七、RT-PCR檢測細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平
　　采用Trizol試劑提取受者C57BL/6小鼠脾臟總RNA,紫外分光光度計(jì)檢測其濃度。每份樣本取2.5μg RNA進(jìn)行反應(yīng),并以GADPH作為對照。GADPH、IL-4,及IFN-γ的引物如下:
　　GAPDH:5‘-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3‘5‘-GGCATGGACTGTGGTC ATGA

9、-3‘
　　IL-4:5‘-ATGTACCAGGAGCCATATC-3‘5‘-CGAAAAGCCCGAAG-3‘
　　IFN-γ:5‘-CTCAAGTGGCATAGATGTGGA-3‘5‘-CAGGTGTGATTCAATG ACGCT-3‘
　　GADPH、IL-4及IFN-γ目的產(chǎn)物分別為237、270和182bp,2%瓊脂糖電泳后紫外線下拍照,經(jīng)掃描后用科達(dá)圖象分析處理軟件1D(2.0版)進(jìn)行分析,結(jié)果以樣品DNA

10、與相應(yīng)GAPDH相對比率表示。
　　八、ELISA檢測移植鼠脾臟IL-4和IFN-γ水平
　　收集分別移植PBS、EGFP-NIT和B7-H4-NIT組受體脾細(xì)胞培養(yǎng)上清,ELISA檢測IL-4和IFN-γ水平。
　　九、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞
　　取l×106/ml脾細(xì)胞于24孔板中,加入佛波醇酯、離子霉素和莫能霉素,37℃孵育4~5h;用含10g/L牛血清白蛋白(BSA)的 PBS液洗滌2

11、次,加入FITC-CD8和PE-Cy5-CD4,室溫孵育30min,用含10g/L BSA的PBS液洗滌2次;用40g/L多聚甲醛4℃固定30分鐘,洗滌后加入穿孔液,室溫靜置20分鐘,PBS液洗滌2次。加入PE-IFN-γ,室溫染色30h,緩沖液洗滌,流式細(xì)胞儀檢測產(chǎn)生IFN-γ的脾細(xì)胞。
　　移植受者小鼠處死后分離脾臟,無菌鋼網(wǎng)(100目)上研磨,制成細(xì)胞懸液。常規(guī)裂解紅細(xì)胞,磷酸鹽緩沖液(PBS液)洗滌2次。尼龍篩過濾細(xì)胞懸液

12、,去除細(xì)胞團(tuán)及未研碎的細(xì)胞塊,以 RPMI1640培養(yǎng)液重懸,塑料培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)2h,除去單核細(xì)胞,收集未貼壁細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度為l×106/ml。一部分培養(yǎng)后加入PE標(biāo)記的抗CD25單抗、APC標(biāo)記的抗FOXP3單抗及FITC標(biāo)記的抗CD4單抗,流式細(xì)胞儀檢測調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。
　　十、腎臟的組織化學(xué)檢測
　　細(xì)胞移植后14天處死動(dòng)物,切除腎組織樣本,福爾馬林固定,石蠟包埋并切削至4μm厚,二甲苯脫蠟后進(jìn)行蘇木素-伊紅染色。

13、r>　　十一、其他觀測指標(biāo)
　　移植術(shù)后第14天每組隨機(jī)處死3只受鼠,取移植腎臟進(jìn)行病理學(xué)檢查;無菌分離受鼠脾細(xì)胞檢測其IFN-γ表達(dá)及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量,其余動(dòng)物觀察移植細(xì)胞存活時(shí)間、血糖水平及體重變化。
　　十二、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　所有數(shù)據(jù)均用配對或不配對的標(biāo)準(zhǔn)T檢驗(yàn)及變異系數(shù)檢驗(yàn),結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(S)表示。P<0.05代表有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　一、成功構(gòu)建pmB7-H4-Ig及pmB7-

14、H4-GFP載體
　　序列測定證實(shí)克隆的mB7-H4全長cDNA閱讀框正確完整,酶切和序列測定證實(shí)mB7-H4分別正確插入pcDNA3.1-hFc和pEGFP-N1載體中,兩種表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染。
　　COS-7細(xì)胞和293T細(xì)胞后可分別表達(dá)可溶性mB7-H4-Fc和跨膜型mB7-H4-GFP。
　　二、轉(zhuǎn)染細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白及B7-H4
　　成功篩選出穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白及B7-H4的NIT細(xì)胞系。熒光顯微

15、鏡檢測發(fā)現(xiàn),兩組細(xì)胞均可在細(xì)胞膜上表達(dá)綠色熒光蛋白;流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn),綠色熒光蛋白的表達(dá)率分別為90%和92%。
　　三、基因修飾的NIT細(xì)胞(EGFP-NIT及B7-H4-NIT)均可分泌胰島素
　　轉(zhuǎn)染第1天及第3天,放免試劑盒檢測EGFP-NIT細(xì)胞及B7-H4-NIT細(xì)胞培養(yǎng)上清中胰島素濃度,發(fā)現(xiàn)兩組細(xì)胞均可分泌胰島素,分泌水平無顯著性差異(p>0.05)。
　　四、B7-H4-NIT細(xì)胞具有免疫抑制功能

16、r>　　CFSE標(biāo)記的體外增殖實(shí)驗(yàn)證實(shí),B7-H4-NIT細(xì)胞作用組小鼠脾細(xì)胞增殖指數(shù)與EGFP-NIT細(xì)胞作用組相比明顯降低,結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　五、B7-H4-NIT受者組脾細(xì)胞高表達(dá)IL-4、低表達(dá)IFN-γ
　　RT-PCR及ELISA檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá),與EGFP-NIT組及PBS組相比,B7-H4-NIT受體組脾細(xì)胞表達(dá)IL-4顯著增高,IFN-γ表達(dá)水平明顯降低。
　　六、B7

17、-H4-NIT細(xì)胞受者組分泌IFN-γ的CD4+和CD8+T細(xì)胞數(shù)量減少
　　與EGFP-NIT及PBS組相比,B7-H4-NIT細(xì)胞受體組的脾細(xì)胞中,表達(dá)IFN-γ的CD4+和CD8+T細(xì)胞數(shù)量明顯減少,尤以CD8+T細(xì)胞更為明顯(p<0.05)。
　　七、B7-H4-NIT細(xì)胞受者組調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量增加
　　流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn),與對照組比較,B7-H4-NIT細(xì)胞受體組CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量

18、明顯增多(p<0.05)。
　　八、B7-H4-NIT受者組單個(gè)核細(xì)胞浸潤減少
　　蘇木素-伊紅染色結(jié)果表明,與對照組比較,B7-H4-NIT細(xì)胞受體組單個(gè)核細(xì)胞浸潤明顯減少,腎包膜處可見NIT細(xì)胞成團(tuán),而對照組則無。
　　九、移植B7-H4-NIT細(xì)胞對T1D小鼠模型的治療作用
　　除PBS組外,移植EGFP-NIT及B7-H4-NIT的兩組小鼠,3天后其血糖水平均降低。EGFP-NIT組血糖水平在移植后第3天

19、輕微下降,7天后逐漸上升,且未能恢復(fù)至正常血糖水平;B7-H4-NIT組在移植后第3天血糖恢復(fù)至正常水平,第12天達(dá)到最低,正常血糖水平維持17天后開始上升,20天后又表現(xiàn)為高血糖。另外發(fā)現(xiàn),NIT-EGFP組小鼠體重持續(xù)減輕,B7-H4-NIT組體重于7天后有所回升,且受者存活時(shí)間比對照組明顯延長。
　　結(jié)論:
　　本研究表明,表達(dá)B7-H4的胰島細(xì)胞植入同種小鼠體內(nèi)后,能抑制同種反應(yīng)性T細(xì)胞增殖,減輕受者對同種細(xì)胞移植物