胃癌與癌前病變中抑癌基因PTEN和微衛(wèi)星不穩(wěn)定的變化以及二者關(guān)系的探討.pdf

1、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文胃癌與癌前病變中抑癌基因PTEN和微衛(wèi)星不穩(wěn)定的變化以及二者關(guān)系的探討姓名：李異玲申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：內(nèi)科學(xué)指導(dǎo)教師：傅寶玉200304013、PCR所用TaqDNA聚合酶、緩沖液、dNTP、Marker、一次性耗材等均購(gòu)自大連寶生物公司。4、免疫組化s—P試劑盒、鼠抗人單克隆抗體濃縮液(1：200)購(gòu)自福州邁新公司。52400PCR擴(kuò)增儀、BIO—RAD垂直電泳槽：美國(guó)PE公司。瓊脂糖電泳儀：北京分析儀器廠

2、。TG—16臺(tái)式離心機(jī)：上海分析儀器廠。恒溫水浴箱：南京化學(xué)儀器廠。二、方法1、飽和氯化鈉法提取組織DNA。2、PCR—SSCP變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)PTEN雜合性缺失。反應(yīng)體積為20一，含引物04pJVl，10Buffer2一(含M9220retool／L)，dNTP200mM，TaqDNA聚合酶1單位，基因組DNA200ng。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，94℃45s，55℃45s，72℃60s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72℃延伸1

3、0rain。PCR產(chǎn)物按l：5與變性緩沖液混合，97℃變性10rain后立即置于冰水中，16％聚丙烯酰胺凝膠電泳4小時(shí)，(丙烯酰胺：甲叉丙烯酰胺29：1，含7mol／L尿素)，電泳后銀染，觀察結(jié)果。若腫瘤組織較正常組織相比，條帶缺失或減弱75％以上者可判定為雜合性缺失。3、PCR—SSCP銀染一ABI測(cè)序系統(tǒng)檢測(cè)PTEN基因突變PCR反應(yīng)體積為20一，含引物25pM，10Buffer2山(含Md20mmol／L)，dNTP200mM，T

4、aqDNA聚合酶1單位，基因組DNA200ng。反應(yīng)條件為：95。C預(yù)變性5min，94。C45s，58。C30s，72。C60s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72。C延伸10mln。PCR產(chǎn)物經(jīng)12％聚丙烯酰胺電泳，銀染，突變帶通過(guò)ABI測(cè)序系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)序。4、PCR—SSCP變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)MSI具體方法同2。結(jié)果判定：與正常組織相比，胃癌及癌前期病變組織有額外的DNA等位片段或出現(xiàn)等位片段泳動(dòng)，即可判斷為MSI。其中1個(gè)位點(diǎn)發(fā)生MSI