益氣養(yǎng)陰化瘀通絡(luò)中藥對(duì)糖尿病胃輕癱大鼠SOD、MDA、HO-1及Bcl-2與Bax基因表達(dá)的影響.pdf

1、目的:糖尿病(diabetes mellitus，DM)幾乎影響全身的各個(gè)器官系統(tǒng)，疾病的持續(xù)時(shí)間以及嚴(yán)重程度可能直接影響器官受累程度，其中胃輕癱(gastroparesis)是胃腸道受累的主要表現(xiàn)之一，以胃動(dòng)力受損、排空延遲為主要特征，主要臨床表現(xiàn)為早飽、腹脹、惡心、嘔吐、不穩(wěn)定的血糖等癥狀。據(jù)最近報(bào)道約27％-65％的1型糖尿病患者及約30％的2型糖尿病患者會(huì)出現(xiàn)胃排空延遲，且多見于女性患者。胃輕癱通常會(huì)出現(xiàn)在10年以上病史的糖尿病

2、患者中，這些患者通常有自主功能紊亂。
　　糖尿病胃輕癱(diabetic gastroparesis，DGP)發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，目前認(rèn)為高血糖狀態(tài)與自主神經(jīng)功能紊亂是DGP發(fā)病的主要因素，同時(shí)胃腸道激素異常、腸神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元減少、Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells ofCajal，ICC)網(wǎng)絡(luò)失調(diào)及微循環(huán)障礙等也與DGP發(fā)病密切相關(guān)。Brownlee提出高糖誘導(dǎo)線粒體產(chǎn)生過多超氧化陰離子而發(fā)生氧化應(yīng)激是糖

3、尿病各種并發(fā)癥的統(tǒng)一發(fā)生機(jī)制。近年來研究證實(shí)氧化應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞凋亡在糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病神經(jīng)病變等多種糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展中都產(chǎn)生十分重要的影響。但關(guān)于氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡在DGP發(fā)病中的關(guān)系及具體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等方面的研究甚少。
　　臨床上我們采用益氣養(yǎng)陰化瘀通絡(luò)中藥（黃芪、熟地、鱉甲、地龍、水蛭、積雪草、丹參、大黃、茯苓、砂仁等）治療DGP取得了較好的療效。本實(shí)驗(yàn)觀察高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激狀態(tài)下DGP大鼠胃排空功能、

4、平滑肌細(xì)胞凋亡、凋亡調(diào)控基因的表達(dá)變化;闡明益氣養(yǎng)陰化瘀通絡(luò)中藥治療DGP的可能作用機(jī)理，為中藥治療DGP提供新的理論依據(jù)。
　　方法:健康清潔級(jí)Sprague Dawley(SD)大鼠30只，體重201-205g，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組)、模型組(DM組)及益氣養(yǎng)陰化瘀通絡(luò)中藥組(ZY組)，每組各10只大鼠。模型組及中藥組大鼠均按50mg/kg一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，S

5、TZ)，而正常對(duì)照組大鼠腹腔注射等體積枸櫞酸緩沖液。72小時(shí)后尾尖取血測(cè)定血糖，以血糖水平≥16.7mmol/L作為糖尿病模型成功的標(biāo)志。造模成功后，中藥組給以益氣養(yǎng)陰化瘀通絡(luò)中藥10ml/(kg·d)灌胃，正常對(duì)照組及模型組給以相同體積生理鹽水灌胃，每天一次，共6周。于第6周末，給予酚紅溶液灌胃，按2ml/kg腹腔注射8％異戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，剖開腹腔，結(jié)扎大鼠賁門及幽門，取出整個(gè)胃部，應(yīng)用酚紅排泄定量檢測(cè)胃排空;部分標(biāo)本置于多聚甲

6、醛固定液中，TUNEL檢測(cè)胃平滑肌細(xì)胞凋亡情況;部分標(biāo)本保存于-80℃冰箱用于制備組織勻漿、提取RNA、蛋白標(biāo)本，檢測(cè)SOD活性，MDA含量;蛋白印跡(Western blot)檢測(cè)胃組織HO-1蛋白含量;Real-time PCR檢測(cè)胃組織HO-1、Bcl-2、Bax基因表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1各組大鼠一般狀況的比較
　　正常對(duì)照組大鼠皮毛色澤正常，反應(yīng)敏捷，精神狀態(tài)佳，體重較實(shí)驗(yàn)開始時(shí)增加，且實(shí)驗(yàn)期間沒有不良

7、反應(yīng)，無大鼠死亡記錄。模型組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素后漸漸出現(xiàn)多飲、多食、多尿，活動(dòng)明顯減少，體重下降，反應(yīng)遲鈍，精神狀態(tài)萎靡等，且實(shí)驗(yàn)期間模型組死亡2只大鼠。益氣養(yǎng)陰化瘀通絡(luò)中藥干預(yù)后的大鼠一般狀況要優(yōu)于模型組大鼠，反應(yīng)較靈活，精神狀態(tài)可，實(shí)驗(yàn)期間中藥組沒有大鼠死亡記錄。
　　2各組大鼠體質(zhì)量及血糖的比較
　　結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組比較，模型組和中藥組大鼠的體質(zhì)量均明顯減輕(P＜0.05);中藥組大鼠體質(zhì)量與模型組相較無明顯

8、變化（P＞0.05）。與正常對(duì)照組相比，模型組與中藥組大鼠血糖水平均顯著升高(P＜0.05）;中藥組大鼠血糖水平較模型組明顯下降(P＜0.05）。
　　3各組大鼠胃排空率的比較
　　結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比，模型組及中藥組大鼠胃排空率均顯著下降(P＜0.05）;中藥組大鼠的胃排空率較模型組顯著升高(P＜0.05）。
　　4各組大鼠胃組織中SOD活性及MDA含量的比較
　　結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比，模型組及中藥

9、組大鼠胃組織SOD活性均明顯降低（P＜0.05）;中藥組SOD活性較模型組明顯提高（P＜0.05）。
　　與正常對(duì)照組相比，模型組及中藥組大鼠胃組織MDA含量明顯升高(P＜0.05）;中藥組MDA含量較模型組明顯下降(P＜0.05）。
　　5各組大鼠胃組織HO-1蛋白表達(dá)的比較
　　結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比，模型組及中藥組大鼠胃組織HO-1蛋白含量均有升高（P＜0.05）與模型組相比，中藥組HO-1蛋白含量顯著升高(

10、P＜0.05)。
　　6各組大鼠胃組織HO-1 mRNA表達(dá)的比較
　　結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比，模型組及中藥組大鼠胃組織HO-1基因表達(dá)水平升高(P＜0.05);其中中藥組大鼠胃組織HO-1基因表達(dá)水平顯著高于模型組大鼠（P＜0.05），這與HO-1蛋白表達(dá)趨勢(shì)一致。
　　7各組大鼠胃平滑肌細(xì)胞凋亡的比較
　　結(jié)果顯示:正常對(duì)照組大鼠胃平滑肌層甚少見凋亡細(xì)胞;與正常對(duì)照組相比，模型組及中藥組大鼠胃平滑肌凋亡細(xì)

11、胞數(shù)量明顯增多(P＜0.05）;與模型組相比，中藥組大鼠胃平滑肌凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少（P＜0.05）。
　　8各組大鼠胃平滑肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)的比較
　　結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比，模型組及中藥組Bcl-2 mRNA表達(dá)水平均明顯下降(P＜0.05）;與模型組相比，中藥組大鼠Bcl-2 mRNA表達(dá)水平增高(P＜0.05）。
　　與正常對(duì)照組大鼠比較，模型組大鼠Bax mRNA表達(dá)水平明

12、顯增高(P＜0.05)，中藥組大鼠Bax mRNA表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化（P＞0.05）;中藥組大鼠Bax mRNA表達(dá)水平較模型組明顯下降(P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1糖尿病胃輕癱大鼠存在明顯的胃動(dòng)力障礙;益氣養(yǎng)陰化瘀通絡(luò)中藥可明顯降低糖尿病胃輕癱大鼠血糖，促進(jìn)胃動(dòng)力，對(duì)糖尿病胃輕癱具有治療作用。
　　2糖尿病胃輕癱大鼠胃組織氧化應(yīng)激水平升高，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)胃平滑肌細(xì)胞凋亡增加可能是糖尿病胃輕癱發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)