基于碳納米管復(fù)合材料的心肌組織工程研究.pdf

1、急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是由于冠狀動脈血液供應(yīng)急劇減少或中斷導(dǎo)致的心肌缺血性壞死。心肌組織本身的再生能力非常有限，一旦壞死后，室壁進行病理性重建，壞死的心肌被纖維化的瘢痕組織取代，導(dǎo)致心肌收縮功能減弱甚至喪失，嚴(yán)重時引起死亡。目前，心肌梗死在臨床中的主要治療方法包括介入治療、藥物治療、冠狀動脈旁路手術(shù)以及心臟移植等等，但是這些方法均存在明顯的局限性。例如，介入治療、藥物治療與冠狀動脈

2、旁路手術(shù)只能在一定程度上緩解癥狀，而心臟移植則面臨供體不足、移植后免疫排斥及并發(fā)癥較多等難以解決的問題。因此，探索新的治療策略與方法已成為目前缺血性心臟疾病治療研究領(lǐng)域的迫切任務(wù)之一。
　　隨著干細(xì)胞、生物材料與組織工程各研究領(lǐng)域的不斷發(fā)展與交叉融合，針對受損心肌組織修復(fù)與重建的心肌組織工程研究近年來進展迅速，為缺血性心臟疾病的治療帶來了新的希望。種子細(xì)胞、支架材料及工程化心肌組織構(gòu)建與移植是心肌組織工程研究的主要內(nèi)容。
　

3、　在種子細(xì)胞方面，干細(xì)胞是心肌組織工程研究的重要細(xì)胞來源。在過去的研究中，已有多種類型的干細(xì)胞被用于心肌組織工程研究，主要包括胚胎干細(xì)胞(ESCs)，誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPSCs)以及多種類型的組織干細(xì)胞。盡管這些種子細(xì)胞均表現(xiàn)出一定的心梗治療潛能，但研究發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞在治療應(yīng)用中也存在一定的局限性，例如:ESCs存在免疫原性及倫理方面的問題;iPSCs具有致瘤性風(fēng)險;間充質(zhì)干細(xì)胞的成心肌分化能力低;心臟干細(xì)胞來源有限等等。到目前為止，理

4、想的種子細(xì)胞來源在科學(xué)界仍未達成共識，因而尋找新的干細(xì)胞來源是當(dāng)前心肌組織工程研究的熱點之一。近年來的研究表明，棕色脂肪組織來源的干細(xì)胞(brown adipose tissue derived stem cells，BASCs)中含有豐富的心臟干細(xì)胞，具有較高的成心肌分化潛能。同時，體內(nèi)移植研究也發(fā)現(xiàn)，BASCs移植到缺血性心肌后可以分化為心肌細(xì)胞，減少心梗面積，改善左室功能。因此，BASCs在心肌再生研究中具有重要的潛在應(yīng)用價值，是

5、心肌組織工程研究中重要的種子細(xì)胞來源之一。然而，由于發(fā)現(xiàn)時間較短，關(guān)于BASCs在心梗治療中的應(yīng)用還有待于深入研究。
　　在支架材料方面，研制合適的支架材料是心肌組織工程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。近年來，生物材料與納米技術(shù)的迅速發(fā)展得到了研究人員的高度關(guān)注，其在心肌組織工程中的應(yīng)用也成為了當(dāng)前研究的熱點之一。納米材料與傳統(tǒng)支架材料的成功整合已經(jīng)成為優(yōu)化傳統(tǒng)支架材料、使其具備特殊理化性質(zhì)的重要手段。鑒于心肌組織具有獨特的電生理特性，心肌內(nèi)分布著交

6、織成網(wǎng)狀的具有電傳導(dǎo)性的浦肯野氏纖維。單個心肌細(xì)胞接受心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)傳來的電沖動產(chǎn)生興奮和收縮偶聯(lián)，心室肌作為一個整體，發(fā)生同步收縮，完成泵血功能。因此，理想的心肌組織工程支架材料應(yīng)該可以模擬心肌的胞外基質(zhì)微環(huán)境;具有電傳導(dǎo)特性及適宜的力學(xué)特性。然而，傳統(tǒng)的支架材料不具備導(dǎo)電特性，而導(dǎo)電納米材料與傳統(tǒng)支架材料進行整合后，能夠明顯提高復(fù)合支架材料的導(dǎo)電性。因此，將具有導(dǎo)電性的納米材料整合入傳統(tǒng)支架材料的策略，引起了研究人員的極大興趣。

7、>　　碳納米管(carbon nanotubes，CNTs)是一種圓柱狀片層結(jié)構(gòu)，具有優(yōu)良的力學(xué)強度、導(dǎo)電特性及熱穩(wěn)定性。通過不同的方法與其他材料制備成復(fù)合材料后，可以使CNTs的溶解性增加、生物相容性改善、細(xì)胞毒性降低以及在很大程度上改善復(fù)合材料的力學(xué)性能及導(dǎo)電性能。與多壁碳納米管(multi-wall carbonnaotubes，MWCNTs)相比，單壁碳納米管(single-wall carbon naotubes，SWCNTs

8、)的直徑分布范圍小，管壁缺陷少，具有更好的均勻一致性。SWCNTs的直徑約為0.6-2nm，長度為微米級，比表面積較大。目前，在組織工程領(lǐng)域中，基于CNTs的復(fù)合導(dǎo)電性納米支架材料已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，并受到研究人員的高度關(guān)注。
　　在心肌組織構(gòu)建與移植方面，主要有兩種途徑，分別為可注射性心肌組織工程及工程化心肌補片。
　　可注射性心肌組織工程:是指在心肌損傷部位，將可注射性支架材料單獨注射或與細(xì)胞和/或生長因子復(fù)合后注射，

9、促進受損心肌功能修復(fù)的一種策略。可注射性支架材料攜帶干細(xì)胞在心梗區(qū)域移植后，材料對心梗微環(huán)境有很好的改善作用，移植的細(xì)胞可以促進心肌的再生，而且，這種方法具有不用制備特殊支架及低侵襲性等特點，易于在臨床上應(yīng)用，因此，可注射性心肌組織工程是一個重要的研究方向。
　　用于心梗治療的可注射性材料有很多種，如纖維蛋白，膠原，Matrigel，藻酸鹽，自組裝多肽及殼聚糖等。然而，這些材料都存在一定的缺點。近年來，聚N-異丙基丙烯酰胺水凝膠(

10、poly N-isopropylacrylamide，PNIPAAm)的成膠特點及良好的生物相容性在臨床上引起了人們的關(guān)注。PNIPAAm的相變溫度(lowercritical solution temperature，LCST)為32℃，當(dāng)PNIPAAm低于LCST時，流動性好，便于在器官、組織或體腔中注射;而在正常體溫下，這種聚合物可以在原位快速形成凝膠。而且，PNIPAAm具有良好的生物相容性，可用于獲取細(xì)胞片層。然而，將SWCN

11、Ts與PNIPAAm制備成水凝膠用于心梗治療的研究目前尚未見報道。
　　工程化心肌補片:可以為細(xì)胞提供合適的微環(huán)境及結(jié)構(gòu)支撐，促進移植細(xì)胞的分化，并可防止細(xì)胞凋亡。因此，心肌補片在心梗治療中得到了廣泛的關(guān)注并成為一個重要的研究方向。然而，大量研究均關(guān)注的是工程化心肌補片的構(gòu)建與移植應(yīng)用，對心肌補片影響心肌組織本身所其有的特化功能結(jié)構(gòu)——閏盤(intercalated disc，ID)的研究，則鮮有報道。
　　ID存在于心肌細(xì)

12、胞之間，是心肌細(xì)胞之間連接和通訊的重要結(jié)構(gòu)，與心肌的電傳導(dǎo)及節(jié)律性收縮密切相關(guān)，主要由粘著連接、橋粒和縫隙連接組成。其中，粘著連接和橋粒主要負(fù)責(zé)心肌細(xì)胞間的力學(xué)耦聯(lián);縫隙連接則與心肌細(xì)胞間的電耦聯(lián)和代謝耦聯(lián)相關(guān)。三者缺一不可，相輔相成，保證ID功能的正常發(fā)揮。我們前期曾以膠原/Matrigel水凝膠材料復(fù)合新生大鼠心肌細(xì)胞(neonate ratventricular myocytes，NRVM)體外構(gòu)建了工程化心肌組織片層，深入研究了

13、在ID自組裝形成過程中，三種連接的時空分布規(guī)律。然而，對于SWCNTs構(gòu)建的導(dǎo)電性工程化心肌組織片層，對心肌細(xì)胞間ID形成、組裝與極化影響的報道，目前尚未見到。
　　基于上述分析，本論文從心肌組織工程研究的兩個重要策略入手，開展以下兩方面的研究。一方面，以PNIPAAm/SWCNTs構(gòu)建可注射性支架材料，攜帶BASCs體內(nèi)移植后對受損心肌進行功能修復(fù)的研究。另一方面，以SWCNTs/膠原復(fù)合支架構(gòu)建工程化心肌組織補片，并研究SWC

14、NTs對再造心肌ID形成、組裝及功能成熟的影響。因此，本論文的研究內(nèi)容分為兩個部分:
　　第一部分:基于PNIPAAm/SWCNTs水凝膠的可注射性心肌組織工程研究
　　本研究首先制備了PNIPAAm/SWCNTs水凝膠，對其理化性能、細(xì)胞相容性及組織相容性進行了評價;并以BASCs為種子細(xì)胞，以PNIPAAm/SWCNTs水凝膠為可注射性支架材料，評估了PNIPAAm/SWCNTs水凝膠對體外培養(yǎng)的BASCs黏附、伸展及增

15、殖的影響;另外，PNIPAAm/SWCNTs水凝膠攜帶BASCs心梗區(qū)域移植后，通過超聲心動圖及組織學(xué)等方法，評估了心梗后受損心肌的功能改善情況，并通過免疫熒光染色觀察了BASCs在心梗區(qū)域的滯留及轉(zhuǎn)歸情況。
　　結(jié)果表明:與對照組PNIPAAm水凝膠相比，PNIPAAm/SWCNTs水凝膠的表面粗糙度明顯增加，并具有優(yōu)良的導(dǎo)電性。PNIPAAm/SWCNTs水凝膠具有良好的細(xì)胞相容性及組織相容性;體外培養(yǎng)條件下可以促進BASCs

16、的黏附與增殖;在H2O2（作為外源性活性氧自由基，ROS）存在條件下，同樣可以增加BASCs的黏附與伸展;利用PNIPAAm/SWCNTs水凝膠作為可注射性支架材料，攜帶BASCs心梗區(qū)域注射后，可以提高BASCs滯留率，增加室壁厚度，減少室壁梗死面積，抑制左室重建，改善心梗后受損心肌的功能。
　　第二部分:基于SWCNTs/膠原的工程化心肌補片構(gòu)建及SWCNTs影響再造心肌ID發(fā)育的研究
　　本研究中，我們采用鼠尾Ⅰ型膠原

17、與SWCNTs制備成復(fù)合支架，對其理化性質(zhì)和生物相容性進行了評價;隨后，利用篩選出的SWCNTs/膠原復(fù)合支架(0.1 mg/mL)作為基質(zhì)，與NRVM共培養(yǎng)，構(gòu)建了工程化心肌補片;在此基礎(chǔ)上，我們對SWCNTs影響再造心肌補片ID組裝、形成及功能發(fā)揮進行了研究。在不同時間點，通過免疫熒光染色、western blotting、透射電鏡及NRVM的自發(fā)鈣瞬變等方法，從形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、超微結(jié)構(gòu)和功能上，對再造心肌ID的蛋白表達、分布、

18、組裝與發(fā)育情況進行了評價。
　　結(jié)果表明:當(dāng)SWCNTs的濃度為0.1mg/mL時，SWCNTs在膠原溶液中分散均勻，沒有明顯的聚集現(xiàn)象，與掃描電鏡結(jié)果一致;隨SWCNTs濃度的增加，膠原溶液中SWCNTs出現(xiàn)不同程度的聚集;原子力顯微鏡結(jié)果說明隨SWCNTs濃度的增加，復(fù)合支架的表面粗糙度也隨之增加;對復(fù)合支架的電傳導(dǎo)性進行測量后，SWCNTs濃度與復(fù)合支架的導(dǎo)電性呈正相關(guān)。Live/Dead染色結(jié)果提示:與其他4組相比，SWC

19、NTs濃度為0.1mg/mL時對細(xì)胞活力的影響最小，說明SWCNTs/膠原(0.1mg/mL)組具有更好的生物相容性。
　　與單純膠原對照組相比，基于SWCNTs/膠原復(fù)合支架構(gòu)建的工程化心肌補片，其免疫熒光染色和透射電鏡檢測結(jié)果均表明SWCNTs不但明顯增強再造心肌組織α-actinin蛋白的表達，可見明顯的肌節(jié)結(jié)構(gòu)，而且顯著促進了縫隙連接蛋白Connexin43蛋白的極化，這提示基于SWCNTs/膠原再造心肌補片具有更加成熟的

20、組織結(jié)構(gòu)和更好的收縮性能。同時，也證實了SWCNTs可以明顯促進再造心肌ID組裝形成與功能成熟。
　　綜上所述，一方面，本研究成功制備了基于含SWCNTs的PNIPAAm水凝膠，并將這種可注射性水凝膠與BASCs復(fù)合后用于心梗區(qū)域移植。研究發(fā)現(xiàn)，PNIPAAm/SWCNTs水凝膠體外培養(yǎng)時可以促進BASCs黏附與增殖，體內(nèi)移植后可以促進受損心肌修復(fù)，改善梗死區(qū)心臟功能。這種基于PNIPAAm/SWCNTs的可注射性水凝膠支架材料對