應(yīng)用DNApooling發(fā)現(xiàn)GRIN2A基因多態(tài)性影響中國(guó)漢族慢性HBV感染者的疾病進(jìn)展.pdf

1、研究背景：HBV感染是一個(gè)嚴(yán)重的全球性公共健康問(wèn)題，全世界大約有3.5億慢性HBV感染者，每年與HBV感染相關(guān)的死亡人數(shù)超過(guò)100萬(wàn)例。HBV的全球發(fā)病率大約為5％，但其分布具有明顯的地域差別，我國(guó)是乙型肝炎的高發(fā)地區(qū)，衛(wèi)生部2008年公布的數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)1-59歲一般人群乙肝表面抗原攜帶率為7.18％。據(jù)此推斷，我國(guó)約有9300萬(wàn)HBsAg攜帶者，其中有感染癥狀的慢性乙型肝炎患者占2000萬(wàn)。HBV感染的自然史包括病毒清除、慢性持續(xù)性

2、HBV感染及HBV感染后出現(xiàn)的并發(fā)癥，包括重癥乙型肝炎、肝硬化和肝癌。持續(xù)性HBV感染是病毒、環(huán)境、宿主基因組等多因素、多基因的不平衡。影響慢性HBV感染者疾病進(jìn)展的因素包括HBV基因組本身的變異，HBV感染者的年齡、性別、長(zhǎng)期酗酒、合并丙型肝炎病毒（HCV）、丁型肝炎病毒（HDV）、人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV）等的感染和宿主基因組的變異。盡管病毒因素包括病毒載量、HBV基因型、HBV-DNA自身的變異已被證實(shí)在乙型肝炎疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要

3、作用，HBV感染的雙胞胎研究、家族聚集性研究和民族研究強(qiáng)烈支持基因遺傳易感性在持續(xù)性HBV感染及HBV感染疾病進(jìn)展中的重要作用。
　　 目的：為了探索影響中國(guó)漢族慢性HBV感染疾病進(jìn)展的遺傳易感基因，對(duì)中國(guó)漢族人進(jìn)行兩階段的基因組關(guān)聯(lián)分析研究，以便尋找影響中國(guó)漢族慢性HBV感染疾病進(jìn)展的單核苷酸多態(tài)性（SNPs）位點(diǎn)，并進(jìn)行大量人群驗(yàn)證，探索相關(guān)基因或遺傳變異位點(diǎn)影響中國(guó)漢族HBV感染向重癥乙型肝炎、肝硬化或肝癌轉(zhuǎn)變的機(jī)制。

4、r>　　 方法：第一階段采用以DNApooling為基礎(chǔ)的Affymetrix全基因組SNP6.0芯片掃描，篩選影響HBV感染不同疾病進(jìn)展的遺傳易感的SNPs。第二階段采用TaqMan探針個(gè)體基因分型的方法進(jìn)行人群驗(yàn)證。人群驗(yàn)證為以醫(yī)院為基礎(chǔ)的病例對(duì)照研究，驗(yàn)證人群為以湖北省漢族人為代表的中國(guó)南方人群（1729例進(jìn)展性HBV感染者vs.628例無(wú)癥狀HBV感染者）和以山東省漢族人為代表的中國(guó)北方人群（215例進(jìn)展性HBV感染者vs.2

5、26例無(wú)癥狀HBV感染者）。HBV感染者入選標(biāo)準(zhǔn)為HBsAg陽(yáng)性同時(shí)HBeAb陽(yáng)性持續(xù)6個(gè)月以上，且不合并HCV、HDV和HIV的感染。第一批驗(yàn)證人群為湖北地區(qū)2357例乙型肝炎患者，他們是2007年9月至2010年3月收集的來(lái)自于武漢同濟(jì)醫(yī)院、武漢協(xié)和醫(yī)院和湖北省中醫(yī)醫(yī)院的住院病人。病例組為1729例進(jìn)展性HBV感染者，包括重癥乙型肝炎患者261例、乙肝相關(guān)性肝硬化患者731例和乙肝相關(guān)性原發(fā)性肝癌患者737例；對(duì)照組為628例無(wú)癥狀

6、HBV感染者。同時(shí)還收集了210例以社區(qū)為基礎(chǔ)的健康人作為健康對(duì)照，健康對(duì)照要求血清HBV標(biāo)志物全為陰性。第二批驗(yàn)證人群為山東地區(qū)441例慢性乙型肝炎患者，包括215例進(jìn)展性HBV感染者和226例無(wú)癥狀HBV感染者。這些HBV感染者是2009年6月至2010年3月收集的青島傳染病醫(yī)院和濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院的住院病人。同時(shí)還收集了210例以社區(qū)為基礎(chǔ)的健康人作為健康對(duì)照。為了減少年齡因素對(duì)HBV進(jìn)展的影響，我們限制無(wú)癥狀HBV感染者和健康對(duì)

7、照年齡均不小于35歲。挑選SNP位點(diǎn)進(jìn)行深入研究的標(biāo)準(zhǔn)為Silhouette width大于0.7，同時(shí)最小等位基因頻率（MAF）大于0.05。根據(jù)HapMap計(jì)劃公布的中國(guó)北京人和日本東京人的基因型頻率可知，選擇的10個(gè)SNP位點(diǎn)均為標(biāo)簽SNP（tagSNP）。采用TaqMan探針?lè)?，運(yùn)用7900HT序列檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行人群驗(yàn)證，SDS2.3軟件閱讀384孔板，統(tǒng)計(jì)各個(gè)SNPs基因型分布，將各個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS17.0

8、軟件，運(yùn)用校正性別、年齡和飲酒狀況的logistic回歸進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。
　　 結(jié)果：以校正性別、年齡和飲酒狀況的logistic回歸計(jì)算不同的遺傳模型（dominant、recessive、additive models）分析結(jié)果。10個(gè)SNPs在湖北省2357例HBV感染者中關(guān)聯(lián)分析顯示，位于ARHGAP24基因上的遺傳變異位點(diǎn)rs346473和rs346482、位于GRIN2A基因上的基因多態(tài)性位點(diǎn)rs11866328、位于

9、BNC2基因上的SNP rs7861010和位于ASCC3基因上的SNP rs12206945與乙型肝炎的疾病進(jìn)展強(qiáng)相關(guān)。遺傳變異位點(diǎn)rs346473，TT基因型攜帶者增加HBV感染者發(fā)生疾病進(jìn)展的易感性（OR 1.849，95％ CI 1.498-2.283，P=1.1×10-8; additive model）；遺傳變異位點(diǎn)rs346482，TT基因型攜帶者增加HBV感染者發(fā)生疾病進(jìn)展的易感性（OR 1.516，95％ CI 1.2

10、33-1.865，P=7.7×10-5; additive model）；GRIN2A基因上的基因多態(tài)性位點(diǎn)rs11866328，攜帶GG純合子的乙型肝炎患者易發(fā)生疾病進(jìn)展（OR，1.645; 95％ CI，1.340-2.020; P=1.96×10-6; additive model）；位于BNC2基因上的SNP rs7861010，GG基因型攜帶者發(fā)生疾病進(jìn)展的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加（OR，1.305; 95％ CI，1.059-1.607

11、; P=1.2×10-2; additive model）；ASCC3基因上的SNP rs12206945，A等位基因（AA+AG）攜帶的乙肝患者較攜帶GG基因型的乙肝患者更易發(fā)生疾病進(jìn)展（OR，1.742; 95％ CI，1.210-2.509; P=3.0×10-3; dominant model）。發(fā)現(xiàn)位于ARHGAP24基因上的兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)（SNP rs346473和rs346482）存在強(qiáng)連鎖不平衡（D’=0.99，r2=0

12、.951），且與GG單倍型相比，單倍型 TT 攜帶者發(fā)展成進(jìn)展性肝炎的幾率增大1.980倍 (95％ CI，1.538-2.545; P=8.1×10-8)。將在湖北省人群中與乙型肝炎進(jìn)展強(qiáng)相關(guān)的三個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)（位于GRIN2A基因上的基因多態(tài)性位點(diǎn)rs11866328、位于BNC2基因上的SNP rs7861010和位于ASCC3基因上的SNP rs12206945）在山東省人群中再次驗(yàn)證，校正年齡、性別和飲酒狀況的logistic回

13、歸顯示：位于GRIN2A基因上的基因多態(tài)性位點(diǎn)rs11866328的遺傳變異仍然與疾病進(jìn)展強(qiáng)相關(guān)（P=1.0×10-2；OR,1.727；95％ CI,1.140-2.646 additive model），而SNP rs7861010和遺傳變異位點(diǎn)rs12206945未見(jiàn)明顯相關(guān)性。聯(lián)合兩次獨(dú)立性研究發(fā)現(xiàn)，在遺傳變異位點(diǎn)rs11866328處，攜帶GG基因型的乙型肝炎患者對(duì)HBV感染的疾病進(jìn)展高度易感（OR 1.684，95％ CI

14、1.404-2.016，P=1.6×10-8）。為了減少性別、年齡因素對(duì)HBV感染者發(fā)生疾病進(jìn)展的影響，對(duì)該基因多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行了性別和年齡分層分析。性別分層分析可見(jiàn)，攜帶GG基因型的男性(OR，1.610; 95％ CI，1.302-1.992; P=1.1×10-5; additive model)、女性(OR，1.776; 95％ CI，1.253-2.525; P=1.0×10-3; additive model)患者發(fā)生HBV感

15、染疾病進(jìn)展的危險(xiǎn)性均明顯增高。35歲以上（包括35歲）年齡分層分析顯示，年齡不小于35歲的攜帶GG純合子的HBV感染者發(fā)生疾病進(jìn)展的易感性增高(OR，1.634; 95％ CI，1.353-1.972; P=3.1×10-7; additive model)。運(yùn)用HapMap報(bào)道的中國(guó)北京人和日本東京人基因型頻率，發(fā)現(xiàn)遺傳變異位點(diǎn)rs11866328在10kb區(qū)域內(nèi)連鎖不平衡（r2≥0.8）。
　　 結(jié)論：基于DNApoolin

16、g的全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）既可以降低全基因組關(guān)聯(lián)分析花費(fèi)，又被證明是一種有效的篩選候選基因及SNP的方法。它不需要預(yù)先根據(jù)一些尚未充分闡明的生物學(xué)基礎(chǔ)來(lái)假設(shè)某些特定的基因或位點(diǎn)與某種疾病相關(guān)聯(lián)，即不再需要在研究之前構(gòu)建任何假設(shè)，是一種高效的篩選候選基因并進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析的研究方法。對(duì)2798例中國(guó)漢族慢性HBV感染者兩次獨(dú)立性人群驗(yàn)證的結(jié)果顯示位于GRIN2A基因上的SNP rs11866328可能是影響中國(guó)漢族HBV感染者疾病進(jìn)展的