牙周組織工程中血小板源性生長因子應(yīng)用的初步研究.pdf

1、目的：本研究通過培養(yǎng)人牙周膜成纖維細(xì)胞，采用冷凍干燥法制備殼聚糖/磷酸三鈣復(fù)合材料并將血小板源性生長因子、殼聚糖/磷酸三鈣支架材料及牙周膜成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外聯(lián)合培養(yǎng)，初步探討血小板源性生長因子對牙周膜成纖維細(xì)胞在該支架材料上三維立體培養(yǎng)的影響，為今后血小板源性生長因子在牙周組織工程中的進(jìn)一步應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：本研究分為兩部分： 1、人牙周膜成纖維細(xì)胞(periodontalligamentfibroblast，P

2、DLF)的體外培養(yǎng)及鑒定：取臨床上因正畸治療需要而拔除的健康新鮮減數(shù)牙，洗去根面血污后刮取根中1/3處的牙周膜組織，用組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行人PDLF的原代培養(yǎng)，按1:4傳代培養(yǎng)，取第5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。以廣譜角蛋白、波形蛋白按常規(guī)ABC法鑒定細(xì)胞起源；倒置顯微鏡觀察原代及傳代培養(yǎng)的PDLF細(xì)胞。 2、血小板源性生長因子(plateletderivedgrowthfactor-BB，PDGF-BB)與殼聚糖/磷酸三鈣支架材料應(yīng)用于牙周組

3、織工程的初步研究：采用殼聚糖和磷酸三鈣通過冷凍干燥法制備成殼聚糖/磷酸三鈣(Chitosan/Tricalciumphosphate，CTCP)復(fù)合材料，并將已純化且連續(xù)傳代的第五代PDLF在CTCP支架材料上進(jìn)行培養(yǎng)。并按加入培養(yǎng)液的不同進(jìn)行分組。以單純加入DMEM培養(yǎng)液為對照組；以加PDGF-BB為實(shí)驗(yàn)組：將PDGF-BB用DMEM培養(yǎng)液稀釋，按終濃度分為以下三組：1ng/ml組、10ng/ml組、100ng/ml組。各濃度PDGF

4、-BB組及對照組分別接種9份標(biāo)本。標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下(37℃、5％CO2、飽和濕度)孵育24h，對細(xì)胞計(jì)數(shù)，折算成每平方毫米面積的材料上細(xì)胞數(shù)，再計(jì)算每組的平均值。按同樣的分組方法，每孔接種細(xì)胞懸液后在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下孵育24h后棄去液體，實(shí)驗(yàn)組加入含PDGF-BB的DMEM培養(yǎng)液，PDGF-BB終濃度同前，對照組只加DMEM培養(yǎng)液。標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下孵育72h后對細(xì)胞計(jì)數(shù)，方法同前。并分別在培養(yǎng)24h和72h后，PDGF-BB(100ng/ml)組和對照組

5、各隨機(jī)取出1份標(biāo)本行掃描電鏡觀察。各組樣本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，行單因素方差分析。采用SPSS11.0軟件計(jì)算。72h增殖率=(72h吸附細(xì)胞數(shù)-24h吸附細(xì)胞數(shù))/24h吸附細(xì)胞數(shù)。 結(jié)果：掃描電鏡結(jié)果顯示CTCP支架材料具有良好的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔隙互相通連。細(xì)胞在支架材料上可呈長梭形、圓形或成片生長。PDGF-BB(100ng/ml)組較對照組其細(xì)胞與CTCP支架材料的伸展更充分，附著狀態(tài)有所改善。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示：與對照組

6、相比，各濃度PDGF-BB組培養(yǎng)24h后均可促進(jìn)hPDLF在CTCP支架材料上的附著，呈濃度依賴關(guān)系，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其中100ng/ml為最有效濃度。同時，不加PDGF-BB時，72hhPDLF增殖率為41.4％；加入1ng/ml、10ng/ml和100ng/mlPDGF-BB時，hPDLF其72h增殖率分別為為143.0％、188.6％和217.4％：與24h結(jié)果相比，PDGF-BB各濃度組培養(yǎng)72h后均能促進(jìn)h

7、PDLF在CTCP支架材料上的增殖，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 結(jié)論： (1)采用冷凍干燥法制備的殼聚糖-磷酸三鈣復(fù)合支架材料具有良好的三維多孔結(jié)構(gòu)，能夠滿足組織工程支架材料的基本要求。人牙周膜成纖維細(xì)胞與殼聚糖.磷酸三鈣復(fù)合材料具有良好的細(xì)胞相容性和細(xì)胞親和性。 (2)PDGF-BB能促進(jìn)人牙周膜成纖維細(xì)胞在殼聚糖-磷酸三鈣復(fù)合支架材料上的增殖，并可改善人牙周膜成纖維細(xì)胞在殼聚糖-磷酸三鈣復(fù)合支架材料