β-,3--腎上腺素受體抗體與心力衰竭的關(guān)系.pdf

1、上世紀(jì)90年代以來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者相繼發(fā)現(xiàn)在DCM等心臟疾病患者血清中存在有β腎上腺素受體(β1和β2AR)的自身抗體，這些自身抗體可通過作用于相應(yīng)受體細(xì)胞外第二環(huán)而產(chǎn)生類激動(dòng)劑樣效應(yīng)，且采用相應(yīng)細(xì)胞外第二環(huán)肽段長(zhǎng)期免疫動(dòng)物，可使其心臟功能及形態(tài)均發(fā)生類似DCM病人的變化。2005年，我們以人工合成的人β3AR細(xì)胞外第二環(huán)的肽段作為抗原，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)篩查了217例心衰病人和100例正常人血清中的抗β3AR抗體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)

2、：心衰患者血清中抗β3AR抗體的陽性率明顯高于正常人(27％vs11％，P＜0.05)。研究還發(fā)現(xiàn)：該抗體具有類β3AR激動(dòng)劑的負(fù)性變時(shí)、變力效應(yīng)，且此效應(yīng)具有不脫敏現(xiàn)象。但是，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果還不足以說明針對(duì)β3AR細(xì)胞外第二環(huán)的自身抗體與心衰發(fā)病的關(guān)系。 本課題進(jìn)行以下三方面的研究：1.不同原發(fā)疾病所致心衰患者血清中，β3AR自身抗體分布的免疫學(xué)特征及其與心衰某些特異性指征的相關(guān)性分析，借以分析β3AR自身抗體在不同原發(fā)疾病心衰發(fā)

3、生中的可能作用。2.在β3AR自身抗體陰性的大鼠，建立增大心臟壓力后負(fù)荷致心衰的動(dòng)物模型，觀察在心衰的發(fā)生過程中是否會(huì)產(chǎn)生β3AR的自身抗體，如果產(chǎn)生，其產(chǎn)生規(guī)律為何。3.通過用β3AR細(xì)胞外環(huán)肽段主動(dòng)免疫正常大鼠，觀察在β3AR自身抗體長(zhǎng)期存在下，心臟結(jié)構(gòu)和功能是否會(huì)發(fā)生改變。 一、心力衰竭患者血清中β3AR自身抗體的種類和可能的臨床意義 目的：本研究分別以合成的人β3AR細(xì)胞外第一環(huán)、第二環(huán)和第三環(huán)表位肽段作為抗原，

4、應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)技術(shù)，檢測(cè)不同原發(fā)疾病所致心衰患者血清中β3AR的自身抗體，并分析抗β3AR自身抗體的免疫反應(yīng)性及其對(duì)心臟功能活動(dòng)的影響，以探討心衰患者血清中抗β3AR自身抗體存在的病理生理意義。 方法：1.研究對(duì)象及標(biāo)本166例繼發(fā)于擴(kuò)張型心肌病(簡(jiǎn)稱擴(kuò)心病，n=30)、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(簡(jiǎn)稱冠心病，n=93)、高血壓性心臟病(簡(jiǎn)稱高心病，n=33)和風(fēng)濕性心臟病(簡(jiǎn)稱風(fēng)心病，n=10)的心衰患者。全

5、部患者除外內(nèi)分泌、自身免疫性疾病、各種感染性疾病和免疫缺陷性疾病，采集血樣前3d避免服用免疫抑制劑和βAR阻滯劑。入選者均于空腹12h后采集靜脈血液并及時(shí)分離血清置于-20℃保存。2.肽段合成：3個(gè)抗原肽段均由西安美聯(lián)生物工程公司合成，相當(dāng)于人β3AR細(xì)胞外第一環(huán)、第二環(huán)及第三環(huán)氨基酸序列的特異性抗原決定簇，合成肽段純度為95％。人β3AR氨基酸序列檢索來自NCBI(AC:P13945，GI:461604)(見表2)。合成的肽段儲(chǔ)存于-

6、20℃?zhèn)溆谩?.檢測(cè)方法：應(yīng)用SA-ELISA檢測(cè)方法。4.判斷標(biāo)準(zhǔn)；抗體水平以標(biāo)本1:20稀釋時(shí)測(cè)定的OD值反映。5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。 結(jié)果：1.正常人和心衰患者血清中β3AR自身抗體的種類及陽性率經(jīng)ELISA篩選發(fā)現(xiàn)，心衰患者及正常人血清中均存在分別針對(duì)β3AR細(xì)胞外第一環(huán)、第二環(huán)和第三環(huán)的自身抗體(依次表示為anti-β3-ECⅠ，anti-β3-ECⅡ和anti-β3-ECm)

7、，但各自陽性率不同。這一結(jié)果提示β3AR自身抗體(主要為anti-β3-ECⅡ抗體)可能與擴(kuò)心病及冠心病所致心衰的發(fā)病過程有關(guān)。2.正常人和心衰患者β3AR自身抗體的水平分析結(jié)果提示，anti-β3-ECⅡ是與心衰(尤其是擴(kuò)心病所致心衰)發(fā)病過程有關(guān)的主要的β3AR自身抗體的種類。3.分析在不同原發(fā)疾病所致心衰中各類β3AR自身抗體(anti-β3-ECⅠ，anti-β3-ECⅡ和anti-β3-ECⅢ)對(duì)心功能的影響。結(jié)果提示：β3A

8、R自身抗體(主要是anti-β3-ECⅡ)與擴(kuò)心病及冠心病所致的心衰有關(guān)，心衰發(fā)病過程中，anti-β3-ECⅡ可能對(duì)由β1AR自身抗體誘發(fā)的心臟功能障礙和心肌損傷中起著心肌保護(hù)的作用。 結(jié)論：1.針對(duì)β3AR細(xì)胞外第二環(huán)的自身抗體，在擴(kuò)心病和冠心病所致心衰患者中的陽性率和/或抗體水平均明顯高于正常人，提示它可能與心衰的發(fā)病過程有關(guān)。2.針對(duì)β3AR細(xì)胞外第一環(huán)的自身抗體，在擴(kuò)心病患者中也有較高的陽性率，但抗體水平較低；針對(duì)β3

9、AR細(xì)胞外第三環(huán)的自身抗體則與心衰發(fā)病無關(guān)。3.心衰發(fā)病過程中，anti-β3-ECⅡ可能對(duì)由β1AR自身抗體誘發(fā)的心臟功能障礙和心肌損傷起著一定的心肌保護(hù)作用。 二、心衰的發(fā)生發(fā)展過程與β3AR自身抗體產(chǎn)生的關(guān)系 目的：為進(jìn)一步探討β3AR自身抗體與心衰發(fā)病的關(guān)系，在β3AR自身抗體陰性的大鼠身上制備了增大心臟壓力后負(fù)荷的心衰模型，借以觀察在心衰發(fā)生發(fā)展過程中，β3AR自身抗體的產(chǎn)生規(guī)律，并分析β3AR自身抗體的產(chǎn)生與

10、心肌β3AR密度及免疫系統(tǒng)機(jī)能變化的聯(lián)系，以便查明β3AR自身抗體在心衰發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用。 方法：1.采用縮窄腹主動(dòng)脈法制備心衰大鼠模型。2.大鼠血清中β3AR自身抗體的測(cè)定。3.大鼠在體心功能測(cè)定，同時(shí)按無菌操作法分離大鼠脾臟。4.心臟組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)，并利用圖象分析技術(shù)進(jìn)行心肌染色切片膠原容積百分比(CVF)的測(cè)定。5.蛋白免疫印跡技術(shù)(WesternBlot)測(cè)定心肌細(xì)胞β3AR含量，采用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定。6.大鼠B淋

11、巴細(xì)胞含量測(cè)定，并分析流式結(jié)果。7.B淋巴細(xì)胞抗體生成能力測(cè)定。 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在心衰發(fā)生發(fā)展過程中β3AR自身抗體具有逐漸產(chǎn)生、緩慢增高、維持、自然消退的變化規(guī)律。心衰模型形成過程中，心肌細(xì)胞β3AR的含量有所改變，但實(shí)驗(yàn)還無法分析β3AR上調(diào)和β3AR自身抗體產(chǎn)生之間是否有因果關(guān)系。結(jié)果提示，β3AR自身抗體的產(chǎn)生可能與心衰發(fā)生發(fā)展過程中機(jī)體免疫系統(tǒng)功能的改變具有內(nèi)在聯(lián)系。 結(jié)論：1.在建立壓力后負(fù)荷型大鼠心衰

12、模型的過程中，原為β3AR自身抗體陰性的大鼠血清中開始出現(xiàn)高水平的β3AR自身抗體，但該抗體具有一定的產(chǎn)生、維持和減退的自我消長(zhǎng)的時(shí)間過程。2.β3AR的產(chǎn)生過程與脾淋巴細(xì)胞抗體生成能力的改變趨勢(shì)一致，但與B淋巴細(xì)胞數(shù)量無關(guān)。3.β3AR自身抗體水平出現(xiàn)峰值的時(shí)間與大鼠心肌細(xì)胞膜受體β3AR的上調(diào)時(shí)間一致，說明二者在功能作用上有一致性。4.本實(shí)驗(yàn)證實(shí)在心衰的發(fā)生發(fā)展過程中，心臟的病理生理改變促進(jìn)了β3AR自身抗體的產(chǎn)生，但其啟動(dòng)β3AR

13、自身抗體產(chǎn)生的確切機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。 三、β3AR自身抗體長(zhǎng)期存在對(duì)在體大鼠心臟結(jié)構(gòu)及功能的影響 目的：采用β3AR細(xì)胞外第二環(huán)的合成肽段主動(dòng)免疫正常大鼠六個(gè)月，觀察被免疫大鼠在β3AR自身抗體的持續(xù)刺激下心臟結(jié)構(gòu)及功能的改變，并探討β3AR自身抗體可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，借以分析β3AR自身抗體在心衰發(fā)病過程中可能的作用機(jī)制。 方法：對(duì)血清中β3AR自身抗體的測(cè)定。大鼠在體心功能測(cè)定。心肌形態(tài)學(xué)指標(biāo)的測(cè)定：采用

14、光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡技術(shù)測(cè)定。采用WesternBlot技術(shù)，進(jìn)行心肌組織β3A-R、eNOScAMP、cGMP、NO(NOx)含量的檢測(cè)。 結(jié)果：1.對(duì)照組大鼠血清中β3AR自身抗體水平始終無明顯改變(P＞0.05)。(見圖11)提示主動(dòng)免疫模型制備成功。2.主動(dòng)免疫過程中大鼠心功能的變化：提示β3AR自身抗體的持續(xù)作用并未造成實(shí)驗(yàn)大鼠心功能的明顯改變，但有改善心功能的傾向。3.主動(dòng)免疫過程中大鼠心肌形態(tài)學(xué)改變特點(diǎn)：提示在主

15、動(dòng)免疫6個(gè)月的情況下，β3AR自身抗體的持續(xù)作用并未造成實(shí)驗(yàn)大鼠心肌結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變。這提示需要進(jìn)一步延長(zhǎng)免疫時(shí)間或建立被動(dòng)免疫心衰模型大鼠，以便最終確定β3AR自身抗體在心衰發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制。4.主動(dòng)免疫過程中大鼠心肌組織各個(gè)含量的測(cè)定。 結(jié)論：1.在不同原發(fā)疾病所致心衰患者及正常人血清中均存在有分別針對(duì)β3AR細(xì)胞外第一環(huán)、第二環(huán)和第三環(huán)的自身抗體，但其中以針對(duì)β3AR細(xì)胞外第二環(huán)的自身抗體(anti-β3-ECⅡ)

16、出現(xiàn)的陽性率和抗體水平為最高(顯著高于一、三環(huán)的自身抗體)，且在心衰病人顯著高于正常人，提示anti-β3-ECⅡ是重要的功能性抗體，參與了心衰(主要是擴(kuò)心病和冠心病所致心衰)的病理生理過程，可能對(duì)由β1AR自身抗體誘發(fā)的心臟功能障礙和心肌損傷起著心肌保護(hù)的作用。2.心衰大鼠模型在心衰發(fā)生發(fā)展過程中產(chǎn)生了β3AR自身抗體，且該抗體具有一定的產(chǎn)生、維持和減退的自然消長(zhǎng)過程；β3AR自身抗體的產(chǎn)生過程與脾淋巴細(xì)胞抗體生成能力增高的趨勢(shì)一致，