大流行流感裂解疫苗的研制及關(guān)鍵技術(shù)的研究.pdf

1、當(dāng)前，高致病性人禽流感H5N1已在15個(gè)國(guó)家和地區(qū)發(fā)生，死亡率高，特別是印尼家族性感染被美國(guó)科學(xué)家證實(shí)為人傳染人事例后，使得大流行流感防控形勢(shì)異常嚴(yán)峻。WHO預(yù)言，下一次流感大流行不是有和無(wú)的問題，而是早和晚的問題。因此，做好大流行流感疫苗研發(fā)和關(guān)鍵技術(shù)平臺(tái)的研究，已成為世界各國(guó)應(yīng)對(duì)流感大流行采取的重大舉措。 疫苗免疫接種是控制高致病性人禽流感最有效而經(jīng)濟(jì)的手段之一，但面臨著高致病性人禽流感病毒H5N1毒株變異、雞胚生產(chǎn)疫苗原料

2、來(lái)源受限、注射接種繁復(fù)等重大問題。因此WHO要求全球加快大流行流感疫苗研發(fā)和關(guān)鍵技術(shù)儲(chǔ)備研究進(jìn)程，為應(yīng)對(duì)流感大流行做好充分的準(zhǔn)備。 目前，高致病性人禽流感病毒H5N1感染主要分布在亞洲，特別是印尼、越南和中國(guó)，對(duì)其分離的毒株進(jìn)行血清學(xué)、致病性和基因結(jié)構(gòu)等分析表明，高致病性人禽流感病毒H5N1具有高度變異的特性，就中國(guó)分離的毒株存在南北之分。因此，WHO要求各國(guó)開展大流行流感原型疫苗的研究。目前大流行流感疫苗的研究重點(diǎn)主要集中在滅

3、活全病毒疫苗、裂解疫苗、減毒噴鼻疫苗、亞單位疫苗等。其中裂解疫苗具有不可多得的優(yōu)勢(shì)：與全病毒滅活疫苗僅可用于成年人的特點(diǎn)比較，可廣泛用于各類人群，尤其是作為禽流感病毒的高危人群-老人和12歲以下的兒童；不存在減毒疫苗毒力恢復(fù)的缺點(diǎn)，更安全；較亞單位疫苗具有更強(qiáng)的免疫原性和制各簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)。目前，大流行流感裂解疫苗已成為世界著名疫苗企業(yè)和研究機(jī)構(gòu)介入的重點(diǎn)，并取得了階段性成果，為流感大流行作好了充分的準(zhǔn)備。 基于大流行流感裂解疫苗應(yīng)

4、對(duì)流感大流行具有不可多得的優(yōu)勢(shì)，我們?cè)趪?guó)內(nèi)率先成功研發(fā)了大流行流感裂解疫苗，解決了我國(guó)“無(wú)”和應(yīng)急的問題。同時(shí)圍繞大流行流感疫苗關(guān)鍵技術(shù)平臺(tái)：針對(duì)高致病性人禽流感病毒H5N1不斷變異，需要運(yùn)用RG技術(shù)來(lái)快速制備疫苗株的問題、雞胚生產(chǎn)原料來(lái)源和質(zhì)量的問題、注射免疫不能產(chǎn)生全面免疫應(yīng)答和接種復(fù)雜的問題進(jìn)行了研究，其研究進(jìn)展如下： 大流行流感裂解疫苗的研制：我們從美國(guó)CDC引進(jìn)大流行流感疫苗株VNH5N1-PR8/CDC-RG(H5N

5、1)，該疫苗株是利用反向遺傳學(xué)技術(shù)，將高致病性人禽流感病毒A/VietNam/1203/2004(H5N1)的HA、NA基因定點(diǎn)突變后和PR8的6個(gè)內(nèi)部基因進(jìn)行重組，得到大流行流感疫苗減毒株。 開展了大流行流感裂解疫苗種子批庫(kù)的研究。通過(guò)SPF雞胚傳代建立了大容量符合疫苗生產(chǎn)的原始種子批、主種子批和工作種子批庫(kù)。分別對(duì)大流行流感疫苗各種子批進(jìn)行了血凝滴度的檢測(cè)、病毒型別的檢定、EID50、無(wú)菌實(shí)驗(yàn)、支原體檢測(cè)、外原因子檢測(cè)及動(dòng)物

6、實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)建立的原始種子批、主種子批和工作種子批庫(kù)具有安全、有效和穩(wěn)定，符合WHO規(guī)定大流行流感疫苗生產(chǎn)的要求。 開展了大流行流感裂解疫苗原液生產(chǎn)的研究。通過(guò)健康雞胚培養(yǎng)、收獲、滅活、裂解大流行流感裂解疫苗病毒，制備疫苗生產(chǎn)裂解病毒抗原。實(shí)驗(yàn)表明病毒培養(yǎng)溫度為33℃、培養(yǎng)時(shí)間為52h，病毒滅活采用1:4000的甲醛20～25℃滅活72h，病毒的純化使用凝膠過(guò)濾Sepharose4FastFlow，病毒裂解選擇濃度為0.5％的

7、TritonX-100，室溫作用2.0h，建立了疫苗生產(chǎn)的最佳生產(chǎn)工藝，制備了大流行流感裂解疫苗原液。 開展了注射型大流行流感裂解疫苗成品和有效性的研究。選用鋁鹽佐劑，采用動(dòng)物模型和抗原吸附率檢測(cè)進(jìn)行鋁佐劑濃度的確定，確定的鋁佐劑濃度為1.2mg/ml。選用3.75、7.5、15.0、30.0、45.0、60.0、75.0、90.0μg/0.5ml8個(gè)疫苗劑量組，分別肌肉免疫小鼠和豚鼠，對(duì)疫苗免疫原性進(jìn)行了初步研究。通過(guò)血凝抑制

8、實(shí)驗(yàn)來(lái)篩選疫苗的有效劑量，結(jié)果表明加鋁鹽佐劑的7.5、15.0、30.0μg/0.5ml是最佳的疫苗劑量組。我們同時(shí)對(duì)小鼠和豚鼠免疫一針和兩針時(shí)的免疫效果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，表明免疫兩針效果明顯優(yōu)于一針。因此，確定的大流行流感疫苗臨床試驗(yàn)為7.5、15.0、30.0μg/0.5ml成品劑量組，免疫兩針，為臨床研究提供了依據(jù)。 開展了注射型大流行流感裂解疫苗安全性和穩(wěn)定性的研究。通過(guò)動(dòng)物過(guò)敏實(shí)驗(yàn)、異常毒性實(shí)驗(yàn)、急性毒性實(shí)驗(yàn)、熱源質(zhì)實(shí)驗(yàn)

9、，結(jié)果表明大流行流感裂解疫苗無(wú)毒性，使用安全。將大流行流感裂解疫苗成品置2～8℃、室溫(22～25℃)、37℃，通過(guò)解吸附單擴(kuò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證抗原含量，免疫Balb/c小鼠測(cè)定疫苗效力(中和抗體)，通過(guò)pH儀檢測(cè)pH值，外觀的觀察來(lái)鑒定疫苗穩(wěn)定性，并通過(guò)疫苗加速實(shí)驗(yàn)，證明制備的大流行流感裂解疫苗可在2～8℃保存兩年以上。 開展了注射型大流行流感裂解疫苗Ⅰ期臨床研究，通過(guò)雙盲實(shí)驗(yàn)完成了疫苗安全性、有效性研究，實(shí)驗(yàn)證明制備的疫苗安全、有效。

10、 大流行流感疫苗關(guān)鍵技術(shù)的研究：圍繞大流行流感疫苗研發(fā)中的疫苗毒株、培養(yǎng)介質(zhì)和免疫途徑的關(guān)鍵技術(shù)問題進(jìn)行了研究，為應(yīng)對(duì)流感大流行疫苗快速研發(fā)做好準(zhǔn)備。 一是針對(duì)高致病性人禽流感病毒H5N1高度變異的問題，開展了RG技術(shù)用于疫苗株的拯救。因?yàn)楦咧虏⌒匀饲萘鞲胁《綡5N1高度變異，需要不斷更換疫苗株，而快速、及時(shí)對(duì)流行株獲得大流行流感疫苗株將是有效控制流感爆發(fā)流行的首要環(huán)節(jié)之一。我們通過(guò)流感病毒8質(zhì)粒拯救系統(tǒng)，在BSL-3培

11、養(yǎng)A/Anhui/1/2005(H5N1)病毒，提取病毒RNA，利用基因重配技術(shù)將該病毒的HA(定點(diǎn)突變)、NA構(gòu)建到雙向表達(dá)質(zhì)粒pHW2000上，將構(gòu)建好的2質(zhì)粒和PR86質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞，獲得重組的PR8/A/Anhui/1/2005疫苗株病毒。運(yùn)用RT-PCR.、血凝實(shí)驗(yàn)、電鏡、間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)拯救的重組疫苗株病毒。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，拯救PR8/A/Anhui/1/2005疫苗株病毒基因序列正確，血凝滴度達(dá)到1:320以上

12、；電鏡下病毒形態(tài)正常，成絲狀和囊狀。CPE證實(shí)病毒毒力明顯降低，符合大流行流感疫苗株的要求，在國(guó)內(nèi)率先建立了反向遺傳學(xué)拯救流感疫苗株的關(guān)鍵技術(shù)平臺(tái)。 二是針對(duì)大流行流感疫苗生產(chǎn)原料來(lái)源的問題，開展了Vero細(xì)胞替代雞胚生產(chǎn)疫苗的研究。構(gòu)建了pCDNA3.1-ST3GalⅢ表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染、G418加壓篩選Vero細(xì)胞，獲得穩(wěn)定高效表達(dá)高致病性人禽流感病毒受體的Vero細(xì)胞株。運(yùn)用改造好的Vero細(xì)胞株培養(yǎng)PR8/A/Anhui/1

13、/2005疫苗株病毒，通過(guò)細(xì)胞病變和血凝實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，PR8/A/Anhui/1/2005疫苗株病毒感染Vero細(xì)胞病毒復(fù)制滴度提高，TCID50達(dá)到106.5-7，較普通的Vero細(xì)胞提高了100-150倍，初步建立了Vero細(xì)胞生產(chǎn)大流行流感疫苗的細(xì)胞系。我們將Eng53/v-aNS基因置換了8質(zhì)粒系統(tǒng)的NS基因，重組病毒理論上可在Vero細(xì)胞上大量復(fù)制，但我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻與預(yù)期值有差異，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)仍在進(jìn)行中。 三是噴鼻型大

14、流行流感疫苗的研究，噴鼻大流行流感疫苗具有快速、簡(jiǎn)便大規(guī)模接種、免疫保護(hù)譜廣的特點(diǎn)。將大流行流感裂解疫苗分別使用不同的佐劑，采用不同的免疫途徑，分別檢測(cè)唾液、肺灌洗液中分泌型IgA，血液中的IgG、IgA，以及運(yùn)用HI實(shí)驗(yàn)來(lái)確定噴鼻疫苗最佳劑型和最佳免疫途徑。結(jié)果表明，蛋白體佐劑與VNH5N1-PR8/CDC-RG(H5N1)制備的噴鼻型大流行流感裂解疫苗具用良好的免疫原性和安全性，其分泌型IgA是各類佐劑中最高的，其中肺灌洗液中IgA

15、滴度為1:640，HI實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明，運(yùn)用蛋白體佐劑噴鼻免疫大流行流感裂解疫苗將是一個(gè)具有良好開發(fā)前景的舉措，。 結(jié)論：為加快適應(yīng)和滿足我國(guó)流感大流行疫苗研發(fā)和關(guān)鍵技術(shù)儲(chǔ)備能力的需求。我們?cè)趹?yīng)急上，已完成針對(duì)越南株大流行流感裂解原型疫苗的研究；圍繞疫苗研發(fā)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略上，針對(duì)高致病性人禽流感病毒H5N1株變異問題，建立了快速制備疫苗株的技術(shù)平臺(tái)、針對(duì)疫苗生產(chǎn)原料來(lái)源和質(zhì)量難以控制的特點(diǎn)，初步建立了Vero細(xì)胞替代雞胚生產(chǎn)疫苗的