基于鄰近表面雜交分析的電化學(xué)生物傳感技術(shù)用于蛋白和核酸的檢測(cè).pdf

1、隨著人類基因組計(jì)劃的完成和功能蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)的研究進(jìn)展，發(fā)展高靈敏的方法用于蛋白質(zhì)和核酸的快速分子監(jiān)測(cè)就成為后基因時(shí)代的主要研究領(lǐng)域。電化學(xué)傳感器由于其儀器簡(jiǎn)單、靈敏、選擇性高等優(yōu)點(diǎn)吸引了許多研究人員的注意，并成為研究的熱點(diǎn)。 基于當(dāng)前對(duì)蛋白質(zhì)和核酸的檢測(cè)技術(shù)提出的高靈敏、高選擇、高特異性和簡(jiǎn)便、高通量的要求，本論文發(fā)展了一系列新的電化學(xué)生物傳感方法用于檢測(cè)蛋白質(zhì)和核酸，為蛋白質(zhì)和核酸分子檢測(cè)提供高性能的技術(shù)平臺(tái)。并通過對(duì)

2、實(shí)際樣品的分析以及與經(jīng)典檢測(cè)方法的結(jié)果對(duì)照，初步驗(yàn)證了這些技術(shù)的實(shí)用性。 (1)在第2章，我們利用核酸適體這一種通過體外組合化學(xué)篩選技術(shù)所得到的對(duì)目標(biāo)蛋白分子具有高親和力的寡核苷酸探針，基于一對(duì)親合性核酸適體探針同時(shí)識(shí)別目標(biāo)分子而空間鄰近導(dǎo)致與某一互補(bǔ)序列雜交使穩(wěn)定性提高這一鄰近效應(yīng)，提出了一種高靈敏的檢測(cè)模型分析物血小板衍生生長(zhǎng)因子BB(PDGF—BB)的表面鄰近雜交分析電化學(xué)適體傳感方法。該法首先在金電極表面利用巰基自組裝技

3、術(shù)固定了巰基修飾的短鏈寡核苷酸探針，設(shè)計(jì)了一個(gè)尾端延伸序列與短鏈寡核苷酸探針互補(bǔ)的PDGF—B核酸適體探針。該適體探針尾端修飾電活性基團(tuán)二茂鐵，且單個(gè)尾端序列與表面固定的短鏈寡核苷酸探針的熔鏈溫度較低。利用該核酸適體探針可成對(duì)地與二聚體目標(biāo)蛋白PDGF—BB同時(shí)結(jié)合，由于鄰近效應(yīng)促進(jìn)兩尾端序列同時(shí)與電極表面固定的兩條短鏈寡核苷酸雜交，使得適體探針末端二茂鐵標(biāo)記與電極充分接近而發(fā)生高效電子傳遞，產(chǎn)生了顯著的氧化還原電流。我們運(yùn)用循環(huán)伏安法

4、、差示脈沖伏安法、阻抗譜對(duì)該法進(jìn)行了系統(tǒng)的表征，證實(shí)了該傳感機(jī)理。結(jié)果表明，該法可實(shí)現(xiàn)PDGF—BB的高特異性地檢測(cè)，響應(yīng)動(dòng)態(tài)范圍可從1.0 pg/mL到20 ng/mL，檢測(cè)限可達(dá)1.0 pg/mL。 (2)鑒于上述鄰近表面雜交分析技術(shù)中涉及一對(duì)鄰近探針同時(shí)與第三探針的雜交，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)這種鄰近雜交對(duì)熱穩(wěn)定性的改善仍然不是充分大，不利于分析靈敏度的提高與探針的設(shè)計(jì)。第3章中，我們?cè)诖藢?shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，基于一對(duì)不同的核酸適體

5、探針與目標(biāo)蛋白同時(shí)結(jié)合而彼此鄰近的效應(yīng)，進(jìn)一步發(fā)展了相關(guān)模型蛋白PDGF—BB檢測(cè)的電化學(xué)適體表面鄰近雜交分析傳感技術(shù)。該法首先在金電極表面利用巰基自組裝技術(shù)固定了巰基修飾的短鏈寡核苷酸探針，設(shè)計(jì)了一個(gè)尾端延伸序列與短鏈寡核苷酸探針5’半片段互補(bǔ)的PDGF—B核酸適體探針，該適體探針尾端修飾電活性基團(tuán)二茂鐵，且單個(gè)尾端序列與表面固定的短鏈寡核苷酸探針的熔鏈溫度較低。同樣地，設(shè)計(jì)了另一個(gè)尾端延伸序列與短鏈寡核苷酸探針3’半片段互補(bǔ)且熔鏈溫

6、度較低的PDGF-B核酸適體探針，其識(shí)別位點(diǎn)與第一適體探針不同，并且尾端序列下游具有與第一核酸適體探針尾端上游有較短的互補(bǔ)序列，這一短互補(bǔ)序列熔鏈溫度也較低。兩條不同的核酸適體探針可同時(shí)識(shí)別PDGF不同位點(diǎn)由于鄰近而相互雜交，雜交體兩尾端序列可與電極表面固定的巰基短鏈寡核苷酸雜交，并使末端二茂鐵標(biāo)記與電極充分接近，產(chǎn)生了顯著的氧化還原電流。結(jié)果表明，該方法檢測(cè)范圍更寬，從0.1 pg/mL到50 ng/mL，檢測(cè)限降低了一個(gè)數(shù)量級(jí)，為0

7、.1 pg/mL。 (3)第4章中，鑒于表面鄰近雜交分析的高特異性與高靈敏度，我們發(fā)展了目標(biāo)核酸分子檢測(cè)的表面鄰近雜交電化學(xué)傳感技術(shù)，進(jìn)一步拓展了表面鄰近雜交分析的應(yīng)用范圍。與蛋白分子表面鄰近雜交不同的是，核酸分子鄰近雜交可利用待測(cè)核酸序列本身構(gòu)成一對(duì)鄰近探針。為此，我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)寡核苷酸檢測(cè)探針，其3’末端修飾二茂鐵，5’半片段與目標(biāo)核酸分子互補(bǔ)且具有較高熔鏈溫度，若目標(biāo)核酸分子存在，檢測(cè)探針與其雜交形成穩(wěn)定的雜交體，雜交體一

8、側(cè)檢測(cè)探針與目標(biāo)核酸分子其余序列鄰近，促進(jìn)與電極表面固定的巰基短鏈寡核苷酸雜交，并使末端二茂鐵標(biāo)記與電極充分接近，產(chǎn)生了顯著的氧化還原電流。與傳統(tǒng)夾心式雜交分析相比，該法保證了末端二茂鐵標(biāo)記與電極充分接近，電子轉(zhuǎn)移效率提高，可望顯著改善靈敏度。且由于鄰近分析使用了更短的互補(bǔ)序列，可有效提高其選擇性。結(jié)果表明，該方法檢測(cè)的線性范圍寬，為1 fM到1 nM，而且能夠成功的識(shí)別不同堿基數(shù)錯(cuò)配的序列。 (4)第5章中，鑒于目前核酸適體較

9、為有限不能滿足大量蛋白檢測(cè)的需要，我們發(fā)展了目標(biāo)蛋白分子檢測(cè)的表面鄰近雜交電化學(xué)免疫傳感技術(shù)，用一對(duì)核酸探針修飾的抗體代替核酸適體探針，將表面鄰近雜交分析拓展運(yùn)用于蛋白質(zhì)的免疫檢測(cè)，為建立蛋白分子檢測(cè)的通用技術(shù)平臺(tái)提供技術(shù)依據(jù)。以前列腺特異性抗原PSA為模型分析物，提出了基于表面鄰近雜交分析的高靈敏PSA的電化學(xué)免疫傳感技術(shù)。此技術(shù)原理與第3章的電化學(xué)適體傳感器類似，利用一對(duì)識(shí)別PSA不同抗原決定簇的單克隆抗體，設(shè)計(jì)了與這一對(duì)單克隆抗體

10、共價(jià)交聯(lián)的兩個(gè)寡核苷酸探針，一個(gè)尾端延伸序列與巰基修飾短鏈寡核苷酸探針5’半片段互補(bǔ)且熔鏈溫度較低，該探針3’端修飾二茂鐵；另一個(gè)尾端延伸序列與巰基修飾短鏈寡核苷酸探針3’半片段互補(bǔ)且熔鏈溫度較低，而且，第二探針尾端序列下游與與第一探針尾端上游有較短的互補(bǔ)序列，這一短互補(bǔ)序列熔鏈溫度也較低。抗體對(duì)與抗原同時(shí)結(jié)合后，兩核酸探針由于鄰近而相互雜交，雜交體兩尾端序列可與電極表面固定的巰基短鏈寡核苷酸雜交，并使末端二茂鐵標(biāo)記與電極充分接近，產(chǎn)生

11、了顯著的氧化還原電流。結(jié)果表明，該方法檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍為25 pg到1 ng，檢測(cè)下限為25 pg，且該免疫傳感器可再生使用。 (5)第6章中，提出了一種基于分子信標(biāo)變構(gòu)控制的電化學(xué)通道法檢測(cè)目標(biāo)核酸分子雜交反應(yīng)的電化學(xué)DNA傳感方法。該方法設(shè)計(jì)運(yùn)用了一種發(fā)夾結(jié)構(gòu)核酸探針分子，其一端標(biāo)記有生物素作為阻塞源，另一端標(biāo)記氨基并通過二硫雜環(huán)化合物共價(jià)固定于金電極表面，電極用巰基十一酸自組裝膜封閉。由于發(fā)夾探針莖部核酸雙鏈螺旋體空間位阻較大

12、，生物素阻塞元與巰基十一酸疏水烷基鏈作用進(jìn)一步提高空間位阻，不利于電活性分子表面擴(kuò)散。當(dāng)探針與目標(biāo)核酸分子雜交時(shí)，探針發(fā)夾構(gòu)象改變，莖部雙鏈結(jié)構(gòu)改變?yōu)槿嵝詥捂溄Y(jié)構(gòu)，阻塞物離開電極表面，在巰基十一酸自組裝膜內(nèi)形成電化學(xué)針孔通道，使得電活性分子可進(jìn)行表面擴(kuò)散，產(chǎn)生電化學(xué)氧化還原電流。使用該方法對(duì)包含第142位密碼子的α地中海貧血基因片斷進(jìn)行了分析。濃度檢測(cè)動(dòng)態(tài)線性范圍為2.8×10-18-8.7×10-8M，檢測(cè)限可達(dá)10-18M。該方法靈

13、敏、特異性好、無需標(biāo)記、可再生，可以很好地用于單堿基錯(cuò)配的區(qū)分。 (6)第7章中，建立了一種基于納米金標(biāo)記及金增強(qiáng)表面吸附伏安分析的新型電化學(xué)免疫傳感技術(shù)。該方法以人免疫球蛋白G(hIgG)為模型分析物，將羊抗人免疫球蛋白G抗體固定于玻碳電極表面構(gòu)成免疫傳感器界面。固定化抗體與分析目標(biāo)物hIgG發(fā)生免疫反應(yīng)而將hIgG捕獲，利用夾心法將納米金標(biāo)記的hIgG抗體結(jié)合于電極表面。通過納米金自催化還原可在電極表面形成大粒徑納米金顆粒，