能量代謝異常與髓性白血病化療耐受的研究.pdf

1、研究背景：
　　 白血病細(xì)胞耐藥是髓性白血病治療中的一大障礙，是治療失敗的主要原因之一。多藥耐藥可通過(guò)P糖蛋白、多藥耐藥性相關(guān)蛋白、拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ、肺抗藥性相關(guān)蛋白介導(dǎo)的多藥耐藥基因的表達(dá)而改變。進(jìn)一步研究白血病的化療耐藥機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)，增強(qiáng)化療敏感性、克服耐藥，具有十分重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　 代謝組學(xué)可對(duì)生物或細(xì)胞代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化的相對(duì)關(guān)系，而越來(lái)越受到人們的重視。研究者

2、利用代謝組學(xué)技術(shù)探索格列衛(wèi)(IM)耐藥與敏感的慢粒白血病(CML)細(xì)胞的代謝物差異，為IM耐藥的治療提供新靶向和新思路。結(jié)果表明:IM耐藥與細(xì)胞增高的糖酵解活性和磷脂翻轉(zhuǎn)有關(guān);對(duì)IM耐藥的K562-r和LAMA84-r細(xì)胞保持了增高的葡萄糖攝取和乳酸生成的高糖酵解代謝表型。
　　 糖酵解活性與腫瘤生成及對(duì)放化療的耐受呈正相關(guān)。通過(guò)抑制糖酵解酶的活性，可阻斷糖酵解的進(jìn)行，從而使得腫瘤細(xì)胞因能量供應(yīng)缺乏而死亡，但正常細(xì)胞不受影響。研

3、究表明，僅依靠抑制有氧糖酵解，并不足以產(chǎn)生顯著的具有臨床意義的抗腫瘤作用。這可能是由于ATP的耗竭只有達(dá)到一定的閾值才能啟動(dòng)細(xì)胞的凋亡或壞死程序，最終導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。
　　 近來(lái)大規(guī)模的基因表達(dá)分析表明在造血系統(tǒng)惡性腫瘤中編碼糖酵解途徑分子的基因選擇性表達(dá)上調(diào)。研究證實(shí)在血液腫瘤細(xì)胞中，亦存在糖酵解異?，F(xiàn)象。3溴丙酮酸(3-BrPA)可有效誘導(dǎo)了多藥耐藥急性髓系白血病(AML)細(xì)胞株HL-60/AR的凋亡，提示阻斷細(xì)胞的能量供應(yīng)

4、有可能克服血液腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性。潑尼松龍耐藥與急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)細(xì)胞高葡萄糖消耗明顯相關(guān)，通過(guò)抑制糖酵解可使對(duì)潑尼松龍耐藥的ALL原代細(xì)胞和細(xì)胞株對(duì)糖皮質(zhì)激素重新敏感，這種增敏作用可通過(guò)細(xì)胞重要的能量傳感系統(tǒng)腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)來(lái)調(diào)控。糖酵解的抑制可活化AMPK，導(dǎo)致mTOR的抑制，進(jìn)而使抗凋亡蛋白Mc1-1表達(dá)下調(diào)。
　　 目前尚未有糖酵解抑制劑聯(lián)合化療用于髓性白血病化療增敏的報(bào)道。本研究以髓性白血病耐藥

5、細(xì)胞能量代謝異常作為切入點(diǎn)，采用分子和細(xì)胞生物學(xué)等方法系統(tǒng)分析研究髓性白血病糖酵解相關(guān)分子的表達(dá)與耐藥形成的關(guān)系，以及在體外調(diào)控糖酵解對(duì)化療敏感性的影響并探討其機(jī)制，從而為逆轉(zhuǎn)髓性白血病化療耐受的治療提供新思路。
　　 第一部分糖酵解相關(guān)分子表達(dá)與髓性白血病化療敏感性的研究
　　 研究目的：
　　 1.探討髓性白血病細(xì)胞糖酵解活性與化療耐受的關(guān)系。
　　 2.探討髓性白血病細(xì)胞糖酵解相關(guān)分子的表達(dá)與化療耐

6、受的關(guān)系。
　　 3.探討髓性白血病細(xì)胞線粒體ATP合成酶的表達(dá)與化療耐受的關(guān)系。
　　 材料和方法：
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng):
　　 對(duì)阿霉素(ADM)敏感和耐藥AML細(xì)胞株(HL-60和HL-60/ADM)，以及對(duì)IM敏感和耐藥CML細(xì)胞株(K562和K562-R)均采用含10％FBS的RPMI1640(青霉素100U/ml，鏈霉素100μg/ml)，置5％CO培養(yǎng)箱、37℃飽和濕度培養(yǎng)。
　　

7、2.臨床標(biāo)本:
　　 54例患者骨髓標(biāo)本來(lái)自南方醫(yī)院血液科和中山人民醫(yī)院血液科2010年12月至2011年11月間住院的非M3型AML患者，骨髓白血病細(xì)胞≥80％。其中初治45例，復(fù)發(fā)9例。男31例，女23例，平均年齡41.6±17.8歲。另選取19例健康對(duì)照者，男11例，女8例，平均年齡39.2±14.1歲，對(duì)照組的年齡、性別構(gòu)成比與AML病例經(jīng)卡方檢驗(yàn)無(wú)明顯差異(p＞0.05)。
　　 3.實(shí)驗(yàn)方法:
　　

8、(1)葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同化療敏感性髓性白血病細(xì)胞株糖酵解活性。
　　 (2)熒光定量PCR檢測(cè)不同化療敏感性髓性白血病細(xì)胞（細(xì)胞株和AML原代細(xì)胞）糖酵解相關(guān)基因(HIF-1α、FBP1、HK-Ⅱ和GLUT1)mRNA的表達(dá)。
　　 (3)酶促法檢測(cè)不同化療敏感性AML患者血清LDH含量。
　　 (4)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同化療敏感性AML患者白血病細(xì)胞CD147的表達(dá)。
　　 (5)免疫印跡(Weste

9、rnBlot)檢測(cè)不同化療敏感性髓性白血病細(xì)胞（細(xì)胞株和AML原代細(xì)胞）線粒體ATP合成酶ATP5B蛋白表達(dá)。
　　 4.統(tǒng)計(jì)分析
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件;統(tǒng)計(jì)結(jié)果用(x)±s表示;兩樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間樣本均數(shù)比較用單向方差分析(one-WayANOVA)，若方差齊性，組間差異采用LSD法做多重比較;若方差不齊采用welch法檢驗(yàn)，組間差異采用Dunnett'sT3法做多重比

10、較。組間率的比較采用卡方檢驗(yàn)。以a=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，采用雙側(cè)檢驗(yàn)。p值≤0.05時(shí)，認(rèn)為有顯著性差異。
　　 結(jié)果：
　　 1.髓性白血病細(xì)胞株糖酵解活性與化療耐受性的關(guān)系
　　 耐藥細(xì)胞株HL-60/ADM和K562-R的糖酵解活性均明顯高于相對(duì)應(yīng)的化療敏感細(xì)胞株HL-60和K562。
　　 2.不同化療敏感性髓性白血病細(xì)胞糖酵解相關(guān)基因mRNA的表達(dá)
　　 (1)髓性白血病細(xì)胞株糖酵解相關(guān)

11、基因mRNA的表達(dá)
　　 HIF-1αmRNA和GLUT1mRNA在耐藥白血病細(xì)胞株HL-60/ADM和K562-R中的相對(duì)表達(dá)水平較化療敏感的野生型細(xì)胞株HL-60和K562高(p＜0.01、p＜0.05)。而另一糖酵解關(guān)鍵酶HK-ⅡmRNA相對(duì)表達(dá)水平在HL-60耐藥細(xì)胞株中明顯低于野生株(p＜0.01)，在K562耐藥細(xì)胞株中顯著高于野生株(p＜0.01)。但糖酵解抑制酶FBP1mRNA相對(duì)表達(dá)水平在HL-60耐藥細(xì)胞株中

12、明顯高于野生株(p＜0.01)，在K562耐藥細(xì)胞株中顯著低于野生株(p＜0.01)。
　　 (2)HIF-1αmRNA在不同化療敏感性AML患者中的表達(dá)未緩解(NR)組患者HIF-1αmRNA表達(dá)量明顯高于對(duì)照組、完全緩解(CR)和部分緩解(PR)組，而在對(duì)照組、CR和PR組中，HIF-1αmRNA表達(dá)量有逐漸升高趨勢(shì)。
　　 (3)FBP1mRNA在不同化療敏感性AML患者中的表達(dá)患者FBP1mRNA表達(dá)量個(gè)體間差異

13、非常大，經(jīng)F檢驗(yàn)提示各組間無(wú)差異(p＞0.05)。
　　 (4)HK-ⅡmRNA在不同化療敏感性AML患者中的表達(dá)NR組患者HK-ⅡmRNA表達(dá)量明顯高于對(duì)照組、CR和PR組，而在對(duì)照組、CR和PR組中，HK-ⅡmRNA表達(dá)量有逐漸升高趨勢(shì)。
　　 (5)GLUT1mRNA在不同化療敏感性AML患者中的表達(dá)NR組患者GLUT1mRNA表達(dá)量明顯高于對(duì)照、CR和PR組，而在對(duì)照組、CR和PR組中，GLUT1mRNA表達(dá)量有

14、逐漸升高趨勢(shì)。
　　 3.不同化療敏感性AML患者血清LDH的表達(dá)NR組患者血清LDH含量明顯高于對(duì)照、CR和PR組，而在對(duì)照組、CR和PR組患者中，血清LDH含量有逐漸升高趨勢(shì)。
　　 4.不同化療敏感性AML患者CD147的表達(dá)化療NR組AML患者骨髓白血病細(xì)胞CD147的表達(dá)明顯高于CR和PR組。
　　 5.不同化療敏感性髓性白血病細(xì)胞線粒體合成酶ATP5B的表達(dá)耐藥細(xì)胞株HL-60/ADM和K562-R的

15、ATP5B蛋白表達(dá)水平明顯低于相對(duì)應(yīng)的化療敏感細(xì)胞株;化療NR組AML患者骨髓白血病細(xì)胞ATP5b蛋白明顯低于CR組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.化療耐藥髓性白血病細(xì)胞株的糖酵解活性均明顯高于相對(duì)應(yīng)的化療敏感野生型細(xì)胞株。
　　 2.HIF-1αmRNA和GLUT1mRNA在耐藥髓性白血病細(xì)胞株中的相對(duì)表達(dá)水平較化療敏感的野生型細(xì)胞株高。
　　 3.化療耐受AML患者骨髓白

16、血病細(xì)胞HIF-1α、HK-Ⅱ和GLUT1mRNA表達(dá)量明顯高于敏感組。
　　 4.化療耐受AML患者骨髓白血病細(xì)胞FBP1mRNA表達(dá)量與敏感組無(wú)差別。
　　 5.化療耐受AML患者血清LDH含量明顯高于敏感組。
　　 6.化療耐受AML患者骨髓白血病細(xì)胞CD147的表達(dá)明顯高于敏感組。
　　 7.線粒體合成酶ATP5B蛋白表達(dá)水平在耐藥髓性白血病細(xì)胞株中明顯低于化療敏感的野生型細(xì)胞株;同樣化療耐受AM

17、L患者骨髓白血病細(xì)胞ATP5B蛋白表達(dá)水平亦明顯低于敏感組。
　　 第二部分抑制糖酵解對(duì)髓性白血病化療耐受的影響及機(jī)制
　　 研究目的：
　　 1.探討抑制糖酵解對(duì)髓性白血病細(xì)胞株化療耐受性的影響。
　　 2.探討改變糖酵解活性影響髓性白血病細(xì)胞株化療敏感性的可能機(jī)制。
　　 材料和方法：
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng):
　　 對(duì)ADM敏感和耐藥AML細(xì)胞株(HL-60和HL-60/ADM)

18、，以及對(duì)IM敏感和耐
　　 藥CML細(xì)胞株(K562和K562-R)均采用含10％FBS的RPMI1640(青霉素100U/ml，鏈霉素100μg/ml)，置5％CO2培養(yǎng)箱、37℃飽和濕度培養(yǎng)。
　　 2.實(shí)驗(yàn)方法:
　　 (1)臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞活力
　　 取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞(HL-60、HL-60/ADM、K562和K562-R)，處理組分別加入不同濃度藥物（糖酵解抑制劑、化療藥、糖酵解抑制劑+

19、化療藥），培養(yǎng)3d，每天計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)目（臺(tái)盼藍(lán)拒染）。采用Weeb系數(shù)檢驗(yàn)糖酵解抑制劑聯(lián)合化療藥是否具有協(xié)同效應(yīng)。
　　 (2)MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力
　　 取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞(HL-60、HL-60/ADM、K562和K562-R)，處理組分別加入不同濃度藥物（糖酵解抑制劑、化療藥、糖酵解抑制劑+化療藥），培養(yǎng)3d，MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力。采用Weeb系數(shù)檢驗(yàn)糖酵解抑制劑聯(lián)合化療藥是否具有協(xié)同效應(yīng)。
　　 (3)葡

20、萄糖消耗實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同化療敏感性髓性白血病細(xì)胞株糖酵解活性。
　　 將106個(gè)不同處理組白血病細(xì)胞(HL-60、HL-60/ADM、K562和K562-R)置入無(wú)血清RPMI1640中，培養(yǎng)4d，收集細(xì)胞上清。按照Glucose(HK)Assay試劑盒說(shuō)明，在波長(zhǎng)340nm處觀察其吸光度，并計(jì)算溶液中的葡萄糖含量。
　　 (4)AnnexinV/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡
　　 將106個(gè)不同處理組白血病細(xì)胞(HL-

21、60、HL-60/ADM、K562和K562-R)培養(yǎng)1d后，采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
　　 (5)RNA干擾HIF1α或GLUT1基因后檢測(cè)耐藥AML細(xì)胞化療敏感性的變化
　　 首先設(shè)計(jì)針對(duì)靶基因HIF1α或GLUT1的shRNA序列，通過(guò)電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)對(duì)耐藥細(xì)胞株HL-60/ADM進(jìn)行轉(zhuǎn)染，再通過(guò)熒光定量PCR和WesternBlo檢測(cè)RNA干擾效果，從而篩選shRNA靶序列。
　　 將shRN

22、A序列利用酶切、連接等基因重組技術(shù)構(gòu)建到慢病毒載體pLVX-shRNA1上，然后轉(zhuǎn)染Lenti-X293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝，將包裝好的病毒感染HT-1080細(xì)胞進(jìn)行病毒滴度測(cè)定;同時(shí)用病毒感染HL-60/ADM細(xì)胞后檢測(cè)RNA干擾效果。
　　 將包裝好的病毒感染HL-60/ADM細(xì)胞，通過(guò)嘌呤霉素篩選3次后建立穩(wěn)定表達(dá)pLVX-shRNA1-HIF1α和pLVX-shRNA1-GLUT1的HL-60/ADM細(xì)胞株。然后，通過(guò)MT

23、T法檢測(cè)經(jīng)不同濃度組ADM處理后這些細(xì)胞株的存活率。
　　 3.統(tǒng)計(jì)分析
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件;統(tǒng)計(jì)結(jié)果用(x)±s表示;兩樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間樣本均數(shù)比較用單向方差分析(one-WayANOVA)，并進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，與對(duì)照組比較用Dunnett-t法檢驗(yàn)。組間率的比較采用卡方檢驗(yàn)。以a=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，采用雙側(cè)檢驗(yàn)。p值≤0.05時(shí)，認(rèn)為有顯著性差異。
　　

24、結(jié)果：
　　 1.抑制糖酵解對(duì)髓性白血病細(xì)胞株增殖的影響
　　 臺(tái)盼藍(lán)染色法和MTT法結(jié)果顯示，糖酵解抑制劑2-DG或3BrPA聯(lián)合ADM對(duì)耐藥細(xì)胞株HL-60/ADM具有顯著協(xié)同作用，而對(duì)野生細(xì)胞株HL-60不具有協(xié)同作用。同樣，2-DG或3BrPA聯(lián)合IM對(duì)耐藥細(xì)胞株K562-R具有顯著協(xié)同作用，而對(duì)野生細(xì)胞株K562不具有協(xié)同作用。
　　 2.抑制糖酵解對(duì)不同化療敏感性髓性白病細(xì)胞株糖酵解活性的影響

25、　　 糖酵解抑制劑2-DG或3BrPA單獨(dú)或聯(lián)合細(xì)胞毒藥物使用均可顯著降低HL-60和K562敏感和耐藥細(xì)胞株葡萄糖的消耗，而單獨(dú)使用細(xì)胞毒藥物，葡萄糖消耗的減少不明顯。
　　 3.抑制糖酵解對(duì)不同化療敏感性髓性白血病細(xì)胞凋亡的影響
　　 糖酵解抑制劑2-DG或3BrPA單獨(dú)或聯(lián)合化療藥處理HL-60、HL-60/ADM、K562和K562-R細(xì)胞24h后，細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯差別;而聯(lián)合處理明顯提高了這些細(xì)胞的壞死率。<

26、br>　　 4.siRNA沉默HL60/ADM細(xì)胞HIF1α或GLUT1基因表達(dá)后化療敏感性改變
　　 構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)pLVX-shRNA1-HIF1α和pLVX-shRNA1-GLUT1的HL-60/ADM細(xì)胞株。MTT結(jié)果顯示，穩(wěn)定表達(dá)pLVX-shRNA1-HIF1α的HL-60/ADM細(xì)胞對(duì)ADM的化療敏感性無(wú)明顯改變，而穩(wěn)定表達(dá)pLVX-shRNA1-GLUT1的HL-60/ADM細(xì)胞對(duì)ADM的化療敏感性明顯提高。<

27、br>　　 結(jié)論：
　　 1.糖酵解抑制劑2-DG或3BrPA通過(guò)抑制葡萄糖消耗可增強(qiáng)ADM對(duì)化療耐藥細(xì)胞藥敏性;同樣，2-DG或3BrPA聯(lián)合IM對(duì)K562-R細(xì)胞具有協(xié)同殺傷作用。
　　 2.2-DG或3BrPA對(duì)髓性白血病細(xì)胞的化療毒性增強(qiáng)作用主要依賴于非凋亡的細(xì)胞死亡途徑。
　　 3.RNA干擾沉默GLUT1基因可提高HL-60/ADM細(xì)胞對(duì)ADM的敏感性，而HIF-1α基因沉默未能明顯提高提高HL-6