骨髓基質(zhì)細(xì)胞聯(lián)合施萬(wàn)細(xì)胞移植治療帕金森病大鼠的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討骨髓基質(zhì)細(xì)胞（BMSCs）聯(lián)合施萬(wàn)細(xì)胞（SCs）腦內(nèi)移植對(duì)BMSCs增殖、分化及對(duì)帕金森?。≒D）大鼠的治療作用。 方法：1、BMSCs培養(yǎng)：無(wú)菌條件下取體重為180g的SD大鼠脛骨和股骨，沖洗髓腔，將細(xì)胞懸液接種到含有15％胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)，7d后進(jìn)行傳代擴(kuò)增，以獲得充足的BMSCs，并用Brdu、流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)。2、SCs培養(yǎng)：取新生8d的SD大鼠雙側(cè)坐骨神經(jīng)，剝離神經(jīng)外膜

2、后剪成碎片，接種到含有15％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)，按1：3進(jìn)行傳代。3、將培養(yǎng)傳至第2代的SCs與第3代BMSCs共培養(yǎng)。用S100免疫熒光法，nestin/Brdu、TH/Brdu免疫熒光法分別鑒定SCs和BMSCs的增殖與分化。4、立體定位下，于左側(cè)黑質(zhì)致密部（SNc）和腹側(cè)被蓋（VTA）注射6-OHDA制備PD大鼠模型。將成功PD大鼠模型隨機(jī)分成3組，即對(duì)照組（注入生理鹽水）：BMSCs移植組；BMSCs+SCs

3、移植組。5、將上述培養(yǎng)傳代至第3代的BMSCs和BMSCs+SCs，濃度為1．0×106細(xì)胞/μl，分別移植到PD大鼠損傷側(cè)紋狀體內(nèi)，于移植后7d、14d、30d檢測(cè)PD大鼠旋轉(zhuǎn)行為變化后，深麻下處死，灌流固定取腦做冰凍切片，行Brdu、TH免疫熒光染色。 結(jié)果：細(xì)胞培養(yǎng)1、BMSCs原代培養(yǎng)24h后，可見(jiàn)瓶底有一些梭形或三角形的成纖維樣細(xì)胞生長(zhǎng)，它們多聚集成集落。此后3d細(xì)胞形態(tài)多趨向于成纖維樣細(xì)胞形態(tài)，胞質(zhì)豐富，核橢圓形，核

4、仁清晰，呈平行排列生長(zhǎng)或漩渦狀生長(zhǎng)，第3代BMSCs表面抗原經(jīng)FCM檢測(cè)，結(jié)果用CellQuest軟件分析顯示，所培養(yǎng)的細(xì)胞CD29和CD90為陽(yáng)性，CD45為陰性，Brdu免疫熒光標(biāo)記陽(yáng)性。2、SCs培養(yǎng)24h后，可見(jiàn)少數(shù)貼壁細(xì)胞，3d后，大量細(xì)胞從組織塊邊緣遷出，胞體較小，呈長(zhǎng)梭形，多為雙極或多極，偶見(jiàn)扁平橢圓形細(xì)胞，免疫熒光呈S100陽(yáng)性反應(yīng)。3、BMSCs+SCs共培養(yǎng)8h后細(xì)胞完全貼壁，細(xì)胞的立體感及折光性一般，突起較短。3d

5、時(shí)，可見(jiàn)細(xì)胞數(shù)量較前明顯增多，部分細(xì)胞胞體收縮，突起細(xì)長(zhǎng)，呈雙極、三極或多極；7d時(shí)細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯增加，胞體立體感增強(qiáng)，一些突起末端出現(xiàn)分支，與相鄰細(xì)胞的突起連接成網(wǎng)狀。免疫熒光雙標(biāo)鑒定結(jié)果顯示。3d時(shí)，可見(jiàn)nestin/Brdu雙標(biāo)細(xì)胞，細(xì)胞核為Brdu紅色標(biāo)記，細(xì)胞漿及突起為nestin綠色標(biāo)記，未見(jiàn)TH/Brdu雙標(biāo)細(xì)胞，7d時(shí)，nestin/Brdu雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)目減少，可見(jiàn)TH/Brdu雙標(biāo)細(xì)胞，細(xì)胞核為Brdu紅色標(biāo)記，細(xì)胞漿及

6、突起為TH綠色標(biāo)記，Brdu/nestin（3d）、TH/Brdu（7d）陽(yáng)性細(xì)胞率分別為（28．1±2．3）％，（19．2±1．6）％，而B(niǎo)MSCs單獨(dú)培養(yǎng)組始終只見(jiàn)Brdu單標(biāo)細(xì)胞，未見(jiàn)陽(yáng)性雙標(biāo)細(xì)胞。在體移植1、細(xì)胞移植后第7d，各組大鼠的旋轉(zhuǎn)行為無(wú)明顯變化；第30d時(shí)，與對(duì)照組比較，BMSCs+SCs共移植組和單純移植BMSCs組旋轉(zhuǎn)行為有較為明顯的改善（P<0．05），其中BMSCs+SCs共移植組較單純移植BMSCs組更為突出

7、（P<0．05）。2、Brdu免疫熒光染色顯示，移植區(qū)Brdu陽(yáng)性細(xì)胞為TRITC紅色熒光標(biāo)記，大多數(shù)細(xì)胞較小，無(wú)突起，呈圓形或橢圓形，少數(shù)呈多邊形或不規(guī)則形態(tài)。3、TH免疫熒光顯示，從第7d起，在移植區(qū)可見(jiàn)胞漿呈FITC綠色熒光標(biāo)記的TH陽(yáng)性神經(jīng)元（12-23個(gè)/視野），呈圓形或橢圓形，無(wú)明顯突起，分布在針道與紋狀體實(shí)質(zhì)的交界處；在第30d，在針道的兩側(cè)TH陽(yáng)性神經(jīng)元增多（22-30個(gè)/視野），有的可見(jiàn)少許突起。BMSCs移植組移植區(qū)

8、也可見(jiàn)FITC綠色熒光標(biāo)記的TH陽(yáng)性神經(jīng)元。經(jīng)過(guò)圖像處理和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，BMSCs+SCs移植組TH神經(jīng)元陽(yáng)性率高于BMSCs單獨(dú)移植組（P<0．05）。 結(jié)論：1、從體重180g SD大鼠脛骨和股骨，通過(guò)貼壁培養(yǎng)法，可以分離和純化得到具有不斷增殖和自我更新能力的BMSCs。2、從新生8d的SD大鼠雙側(cè)坐骨神經(jīng)分離得到的細(xì)胞，體外培養(yǎng)后可被特異性抗體S100標(biāo)記，觀察到細(xì)胞形態(tài)特征與文獻(xiàn)報(bào)道一致，證實(shí)是SCs。3、在體內(nèi)、外條件下，