基因點(diǎn)突變檢測新方法及新型界面設(shè)計(jì)的免疫傳感器研究.pdf

1、人類的許多遺傳性疾病都是由于基因的變異引起的，其中尤以單堿基的突變，即單堿基多態(tài)性最為普遍。實(shí)現(xiàn)對這些基因單堿基突變的早期、準(zhǔn)確、簡便、快速的確認(rèn)，對于人類相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理研究及早期治療具有非常重要的意義。目前，有關(guān)單堿基突變的檢測方法已有許多報(bào)道。而這些傳統(tǒng)的方法普遍操作繁瑣費(fèi)時(shí)、不易定量、儀器昂貴、且對工作人員要求較高的專業(yè)技能，因此僅能在少數(shù)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。開發(fā)一些簡便、價(jià)廉、精確且易于臨床推廣的方法是一件很有價(jià)值的工作。此外，由于

2、電化學(xué)生物傳感器具有制造簡單、靈敏度高、價(jià)格低廉而被廣泛研究、并已在生物檢測中逐步得到了應(yīng)用。然而，有效的生物活性組分的固定方法是構(gòu)建性能優(yōu)良生物傳感器的關(guān)鍵，如何將生物活性組分有效地固定在電極表面的固定化方法，以及傳感器的重現(xiàn)性和重復(fù)使用性等方面存在的問題，嚴(yán)重阻礙了生物傳感器的進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用?；诋?dāng)前基因單堿基突變檢測技術(shù)和生物傳感技術(shù)敏感膜構(gòu)建中存在的問題，本研究論文發(fā)展了一系列新的基因單堿基突變檢測技術(shù)及新型界面設(shè)計(jì)的生物傳感

3、器，實(shí)現(xiàn)了對目標(biāo)物的高靈敏測定。主要內(nèi)容如下： （1）利用核酸標(biāo)記金納米顆粒凝集變色的光學(xué)特性，提出了一種基于DNA連接酶反應(yīng)和納米金聚集特性的比色檢測方法，用于單堿基突變的檢測（第2章）。通過將高忠實(shí)性DNA連接酶的等位特異連接特性與納米金聚集體系相結(jié)合，發(fā)展了一種簡便且不需要精確溫度控制的比色檢測方法，可以用于單堿基突變的直接檢測。此外，連接反應(yīng)能在較高的溫度下進(jìn)行，因而減少了因非相關(guān)鏈與探針標(biāo)記納米金的非特異作用而引起的背

4、景干擾。該方法可以分為三步來完成：首先是雜交反應(yīng)，使兩個(gè)金標(biāo)探針與DNA目標(biāo)鏈雜交形成雙鏈結(jié)構(gòu)；隨后的連接反應(yīng)中，使完全匹配的連接、錯配的不連接；最后由熱處理步驟來分析探針的連接情況。當(dāng)加熱反應(yīng)混合液，使形成的DNA雙鏈熔鏈時(shí)，對于完全匹配的情況，溶液的顏色不會恢復(fù)到紅色。而對于錯配的情況，由于聚集金納米顆粒的重新解離，溶液的顏色又回復(fù)到紅色。我們用該方法對結(jié)腸癌k-ras基因的第12位密碼子的突變情況進(jìn)行了檢測，使突變型和野生型得到了

5、很好的區(qū)分。此后，我們又將這一檢測體系發(fā)展用于同種溶液中多目標(biāo)鏈的同時(shí)檢測（第3章）。簡言之，長鏈DNA標(biāo)記的納米金在較高的溫度下首先發(fā)生雜交反應(yīng)，接著在較低的溫度下，金標(biāo)的短鏈DNA發(fā)生雜交反應(yīng)。然后，在連接反應(yīng)中，完全匹配的進(jìn)行連接，而有錯配的不能發(fā)生連接。最后，逐步升溫進(jìn)行分析，當(dāng)溫度達(dá)到某一形成的雙鏈的熔鏈溫度時(shí)，對于完全匹配的情況，溶液的紫外光譜無改變。而對于有錯配的情況，由于納米金聚集體的解離，溶液的光譜發(fā)生改變。使用該方法

6、，對β地中海貧血基因的第17位密碼子和-28位點(diǎn)突變的情況（這兩種突變是中國西南省份發(fā)病率最高的四種突變中的兩種）成功地進(jìn)行了同時(shí)檢測。也是基于納米金凝集變色這一特性，發(fā)展了一種用比色法實(shí)時(shí)監(jiān)測等溫滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)的方法，并用于單堿基突變的檢測（第4章）。使用該方法實(shí)現(xiàn)了對非PCR擴(kuò)增實(shí)際基因DNA樣品的靈敏檢測。 （2）分子信標(biāo)技術(shù)，由于非標(biāo)記、靈敏且具有較高的選擇性，已被證明是一種非常有用的核酸檢測方法。在第5章，發(fā)展了一種新的

7、、基于分子信標(biāo)變構(gòu)控制的電化學(xué)通道法，用于DNA雜交反應(yīng)的檢測。該方法靈敏、特異性好、無需標(biāo)記、可再生，并且可以很好地用于單堿基錯配的區(qū)分。首先，將標(biāo)記有生物素（作為阻塞物）的分子信標(biāo)固定于金電極表面，然后用巰基11酸封閉電極，形成分子印跡結(jié)構(gòu)。當(dāng)雜交反應(yīng)發(fā)生時(shí)，阻塞物遠(yuǎn)離電極表面，形成電化學(xué)通道，因此電化學(xué)檢測信號極大地增強(qiáng)。使用該方法對包含第142位密碼子的α地中海貧血基因片斷進(jìn)行了分析。濃度檢測動態(tài)線性范圍為2.8×10-16-8

8、.7×10-8M，檢測限可達(dá)10-18M。利用這種相似的電化學(xué)通道原理，我們提出了一種基于分子信標(biāo)識體的電化學(xué)傳感方法，用于人體凝血酶的檢測（第6章）。在凝血酶識體的5’端增加核苷酸（堿基），使它與識體3’端的堿基相互匹配，形成分子信標(biāo)識體。當(dāng)有凝血酶存在時(shí)，發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)被破壞，形成配基鍵合的結(jié)構(gòu)。這種構(gòu)象的改變，引起電化學(xué)通道處于‘開’的狀態(tài)，從而放大電化學(xué)檢測信號。與已報(bào)道的電化學(xué)凝血酶檢測方法相比，本文的方法可以使檢測信號放大幾個(gè)數(shù)

9、量級。并且，這種基于分子信標(biāo)識體構(gòu)象互變的電化學(xué)通道法可以用于構(gòu)建其它電化學(xué)生物傳感器，以用于蛋白質(zhì)或其它化合物的檢測。 （3）在第7章，對等離子體聚合膜用于電容型免疫傳感界面的構(gòu)建進(jìn)行了研究。掃描電子顯微鏡照片和紅外光譜圖顯示，電極表面所形成的等離子體聚合膜均勻、平整、無針孔，并且具有大量氨基。循環(huán)伏安圖表明，形成的等離子體聚合膜具有良好的絕緣性。為了驗(yàn)證用這種方法構(gòu)建電容型免疫傳感器的可行性，實(shí)驗(yàn)將羊抗人IgG抗體固定到等離

10、子體聚合膜修飾的電極表面，制成免疫電極，用于人IgG的檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，等離子體聚合膜比較適合用于電容型免疫傳感界面的構(gòu)建。在第8章，提出了一種基于1，6-己二硫醇和納米金自組裝膜的可逆抗體固定化程序，仍然以人IgG作為研究體系，考察了用于電容型免疫傳感界面構(gòu)建的可行性。實(shí)驗(yàn)首先通過已二硫醇在金表面的自組裝形成有機(jī)絕緣單層膜，當(dāng)該電極置入膠體金溶液后，由于負(fù)電性納米金與表面的巰基發(fā)生強(qiáng)相互作用，在電極表面形成一顯負(fù)電性的納米金表層。因

11、此，利用靜電吸附作用，就能實(shí)現(xiàn)顯正電性的抗體在電極表面的固定。免疫反應(yīng)后，通過用具有極端Ph值的鹽溶液洗滌電極，就能將電極表面的免疫復(fù)合物層洗脫，實(shí)現(xiàn)傳感界面的再生。與傳統(tǒng)的共價(jià)鍵合固定抗體的方法相比，這種可逆固定化程序顯示了良好的優(yōu)勢。 （4）分別在本論文的第9章和第10章，發(fā)展了基于酶催化沉積放大效應(yīng)和金標(biāo)免疫復(fù)合物放大效應(yīng)的免疫分析方法。在第9章中，先通過免疫夾心反應(yīng)，將酶標(biāo)抗體（羊抗人IgM-HRP）固定到電極表面。通過

12、HRP催化雙氧水氧化3,3’-二氨基聯(lián)苯胺在電極表面形成不溶性沉積物，從而放大電化學(xué)阻抗檢測信號。在第10章，當(dāng)免疫結(jié)合抗原(補(bǔ)體C3)后,通過免疫夾心法結(jié)合固定一抗和二抗標(biāo)記的納米金復(fù)合物,從而實(shí)現(xiàn)電極計(jì)時(shí)電位檢測信號的放大。這兩種方法都是通過蛋白A實(shí)現(xiàn)抗體的定向固定。傳感器的信號響應(yīng)與人免疫球蛋白M (IgM)或補(bǔ)體C3的濃度在2.14 – 670 ng/Ml和0.12 - 117 ng/Ml范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，檢出限分別達(dá)到

13、0.08 ng/Ml 和0.02 ng/Ml。 （5）在第11章，提出了一種基于電聚合膜和聚電解質(zhì)層的抗體固定化方法，并用于壓電免疫傳感分析的研究。首先采用電聚合方法，在壓電石英晶體電極表面形成一層聚鄰苯二胺薄膜，然后通過自組裝PSS，在電極表面形成聚陰離子荷電表面,通過控制溶液的Ph值，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)分子（以羊抗人IgG抗體為模板）的固定。傳感器的頻率響應(yīng)和人IgG的濃度在1.67～196 μg /Ml的范圍內(nèi)存在良好的線性關(guān)系。

14、并且，通過改變?nèi)芤旱腜h 值，PSS和蛋白質(zhì)層可以很容易地被洗脫，使免疫傳感器獲得再生。在第12章，研究了磁性納米顆粒用于壓電免疫傳感界面的構(gòu)建。首先將模板分子（羊抗人IgG抗體）結(jié)合到磁性納米顆粒上，然后在永久磁鐵磁場的作用下，實(shí)現(xiàn)在壓電晶體表面的固定。制備的壓電免疫傳感器實(shí)現(xiàn)了IgG的檢測。壓電晶振的頻率響應(yīng)和IgG濃度在0.6-34.9 μg / Ml的范圍內(nèi)，成良好的線性關(guān)系，檢測限為0.4 μg /Ml。免疫反應(yīng)后，只需將磁鐵