西羅莫司對大鼠腎臟缺血再灌注損傷早期的保護及對腎小管上皮細(xì)胞修復(fù)的影響.pdf

1、缺血再灌注損傷是實體器官移植不可避免的一個階段，在腎移植中，因腎臟缺血再灌注損傷的存在，可顯著增加腎移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)發(fā)生率，同樣腎小管上皮細(xì)胞的修復(fù)需要相對較長一段時間，從而導(dǎo)致腎移植術(shù)后移植腎功能延遲恢復(fù)，從長遠考慮可能會影響移植腎和受者的長期存活。腎小管細(xì)胞培養(yǎng)模型、動物實驗和臨床研究均提示腎臟缺血再灌注損傷介導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞死亡有壞死和凋亡兩種形式。早期即出現(xiàn)大量腎小管上皮細(xì)胞凋亡和壞死，腎小管上皮細(xì)胞受累后主要發(fā)生去分化，

2、細(xì)胞骨架的完整性和極性受到損害，最終導(dǎo)致腎組織結(jié)構(gòu)破壞，從而影響腎功能。晚期在各種修復(fù)機制的作用下發(fā)生去分化的腎小管上皮細(xì)胞增殖、移行，并進行再分化，腎小管上皮細(xì)胞增殖的逐步啟動后，經(jīng)歷一段時間后受損的部分腎功能逐漸恢復(fù)。作為實體器官移植與缺血再灌注損傷并存的現(xiàn)狀，我們應(yīng)采取積極有效手段和方法，最大程度上抑制腎小管上皮細(xì)胞的凋亡，減輕腎臟缺血再灌注損傷帶來的不利影響，保護腎功能，對于減少腎移植術(shù)后移植腎功能延遲恢復(fù)以及急性排斥反應(yīng)發(fā)生率

3、，最終達到延長移植腎和受者的存活時間的目的，具有深遠的臨床意義。
　　西羅莫司(SRL)是哺乳類SRL靶分子(mammaliantargetofrapamycin，mTOR)抑制劑，動物實驗和多年的臨床應(yīng)用結(jié)果均顯示，以SRL為主而不含CNI的免疫抑制方案或?qū)NI類免疫抑制劑轉(zhuǎn)換為以西羅莫司為主的免疫抑制方案后與以CNI為基礎(chǔ)的免疫抑制方案相比，能顯著降低因CNI類腎毒性造成的腎移植術(shù)后血肌酐呈爬行性上升的趨勢，腎功能明顯好轉(zhuǎn)。

4、因西羅莫司幾乎無腎臟毒性，肝毒性較低，且與CNI類為基礎(chǔ)的免疫抑制方案相比，患者的1年移植物存活率、急性排斥反應(yīng)發(fā)生率均無明顯差異，腎功能卻明顯優(yōu)于CNI組。對腎移植術(shù)后血肌酐呈階梯性、爬行性慢性上升的患者，并經(jīng)病理確診的因CNI類腎毒性和慢性移植腎病的患者，適時的進行SRL轉(zhuǎn)換治療可明顯改善移植腎功能，延長移植腎和受者的存活時間。
　　目前，關(guān)于SRL對缺血再灌注損傷的作用仍存在爭議。研究發(fā)現(xiàn)SRL可能通過以下機制明顯減輕大鼠腎

5、臟缺血再灌注損傷和改善腎功能:(1)通過非直接通路激活T細(xì)胞凋亡程序，阻止了樹突狀細(xì)胞(DC)的抗原呈遞，并進一步抑制其成熟;(2)減少細(xì)胞因子的分泌，阻止DC在腎組織遷移聚集;周四桂等用SRL處理經(jīng)缺氧復(fù)氧的血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過抑制ROS、JNK、NF-κB的信號傳導(dǎo)途徑，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞與中性粒細(xì)胞的粘附。YangB等發(fā)現(xiàn)使用SRL干預(yù)腎臟缺血再灌注損傷，主要是激活了24KDCaspase-3，減少凋亡的發(fā)生，同時減少遠曲小管中Fas

6、的表達，通過減輕Fas信號途徑引起的免疫損傷，起到保護缺血腎臟再灌注損傷的作用。BohmovaR等在轉(zhuǎn)基因高血壓大鼠腎缺血再灌注損傷中觀察發(fā)現(xiàn)，小劑量的SRL能夠減輕由于腎素產(chǎn)生過多引起的腎臟再灌注損傷。但是也有一些學(xué)者持相反的觀點，在體外，SRL在1ng/ml時抑制鼠的近曲小管細(xì)胞的增生，同時通過抑制腎小管細(xì)胞中70kDaS6蛋白激酶來發(fā)揮促進凋亡作用。在體內(nèi)SRL通過抑制腎小管細(xì)胞再生和增加腎小管細(xì)胞的凋亡，抑制腎缺血再灌注后腎小管

7、的再生，影響損傷的修復(fù)，從而延緩腎功能的恢復(fù)。LuiSL等報道SRL在1天、3天時降低增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達，但是第7天時與對照組沒有差別，表明SRL會加重腎臟的損害主要是通過抑制腎小管細(xì)胞的再生而延緩了腎功能的恢復(fù)，但并不是一直抑制腎小管細(xì)胞的再生。
　　在缺血再灌注損傷中，不同劑量的SRL對不同時期大鼠腎缺血再灌注損傷及腎小管上皮細(xì)胞凋亡后增殖、修復(fù)作用尚不明確。我們推測，在缺血再灌注損傷早期，SRL的抗凋亡作用可能

8、會抑制腎小管上皮細(xì)胞的壞死，起到對損傷腎臟組織的保護作用，但在后期隨著腎小管上皮細(xì)胞修復(fù)程序的逐步啟動，其抗增殖作用可能會抑制腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞增殖、移行、再分化以及骨架的重建，進而影響腎功能恢復(fù)并存在劑量的依賴性和可逆性。我們研究發(fā)現(xiàn)給于大鼠SRL3mg/(kg.d)，其谷濃度為腎移植術(shù)后早期治療濃度，以此劑量為標(biāo)準(zhǔn)我們建立大鼠腎缺血再灌注損傷模型，通過檢測腎臟損傷敏感標(biāo)志物NGAL、IL-18;凋亡基因Fas、Bcl-2和PCNA

9、蛋白表達，腎小管上皮細(xì)胞修復(fù)因子HGF和BMP-7mRNA表達等方面，研究其對腎缺血再灌注損傷及腎小管上皮細(xì)胞修復(fù)的綜合影響。
　　第一部分:西羅莫司對大鼠腎臟缺血再灌注損傷早期的保護
　　目的:探討西羅莫司(SRL)對不同時期大鼠腎缺血再灌注損傷的影響。
　　方法:
　　1.選用雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠共90只，隨機均勻分為五組:sham、I/R、UR+SRLlmg/(kg.d)、I/R+S

10、RL3mg/(kg.d)、I/R+SRL5mg/(kg.d)。
　　2.建立大鼠缺血再灌注損傷模型。
　　3.藥物各組術(shù)前3天及術(shù)后每日給予對應(yīng)劑量SRLlmg、3mg、5mg與10ml生理鹽水灌胃至各個觀察日。
　　4.sham、I/R給予等量生理鹽水灌胃至各個觀察日。
　　5.術(shù)后1、3、7天每組各處死6只大鼠取全血及腎組織，檢測血清肌酐、β2-MG;
　　6.ELISA法測定中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運

11、載蛋白(NGAL)、IL-18;
　　7.HE染色評價組織病理學(xué)改變;
　　8.免疫組化SABC法檢測腎組織Fas、Bcl-2蛋白的表達;
　　9.Westem-blot技術(shù)檢測Fas、Bcl-2蛋白表達強度;
　　10.脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測腎組織細(xì)胞凋亡率。
　　結(jié)果:
　　1.術(shù)后1、3天血Cr、β2-MG、IL-18、Fas和Bcl-2水平、病理學(xué)評分、

12、Fas和Bcl-2蛋白陽性表達率、凋亡指數(shù)均升高，除Bcl-2水平外sham＜I/R+SRL5mg/(kg.d)＜I/R+SRL3mg/(kg.d)＜I/R+SRL1mg/(kg.d)＜I/R(P＜0.05)。
　　2.Bcl-2水平:I/R+SRL5mg/(kg.d)＞I/R+SRL3mg/(kg.d)＞I/R+SRL1mg/(kg.d)＞I/R＞sham(P＜0.05)。
　　3.術(shù)后7天Fas、Bcl-2水平:I/R+

13、SRL5mg/(kg.d)與sham和I/R+SRL1mg/(kg.d)比較有差異(P＜0.05);
　　4.NGAL水平術(shù)后1天高于sham(P＜0.05)。凋亡指數(shù)I/R+SRL5mg/(kg.d)與余四組比較有差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.成功建立大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型。
　　2.西羅莫司在缺血再灌注損傷早期通過其顯著抑制腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞凋亡的作用，起到保護腎功能的作用。
　　3.

14、西羅莫司在缺血再灌注損傷早期對腎功能保護具有劑量依賴性。
　　第二部分:西羅莫司對大鼠腎小管上皮細(xì)胞修復(fù)的影響
　　目的:探討西羅莫司(SRL)對不同時期大鼠腎小管上皮細(xì)胞修復(fù)的影響。
　　方法:
　　1.選用雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠共90只，隨機均勻分為五組:sham、I/R、I/R+SRL1mg/(kg.d)、I/R+SRL3mg/(kg.d)、I/R+SRL5mg/(kg.d)。

15、　　2.建立大鼠缺血再灌注損傷模型。
　　3.藥物各組術(shù)前3天及術(shù)后每日給予對應(yīng)劑量SRL1mg、3mg、5mg與10ml生理鹽水灌胃至各個觀察日。;
　　4.sham、I/R給予等量生理鹽水灌胃至各個觀察日。
　　5.術(shù)后1、3、7天每組各處死6只大鼠取全血及腎組織，檢測血清肌酐;
　　6.ELISA法測定β2-MG、肝細(xì)胞生長因子(HGF)水平;
　　7.HE染色評價組織病理學(xué)改變;
　　8.免疫

16、組化SABC法檢測腎組織增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)蛋白的表達;
　　9.RT-PCR技術(shù)檢測修復(fù)因子HGF的mRNA、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（BMP-7）mRNA表達。
　　結(jié)果:
　　1.術(shù)后1、3天血Cr、β2-MG、病理學(xué)評分均升高:sham＜I/R+SRL5mg/(kg.d)＜I/R+SRL3mg/(kg.d)＜I/R+SRL1mg/(kg.d)＜I/R(P＜0.05);
　　2.術(shù)后1、3天血HGF值、HG

17、FmRNA、BMP-7mRNA水平和1、3、7天PCNA水平:sham＜I/R+SRL5mg/(kg.d)＜I/R+SRL3mg/(kg.d)＜I/R+SRL1mg/(kg.d)＜I/R(P＜0.05);
　　3.Sham術(shù)后各時期均未見增殖細(xì)胞，余四組均有大量細(xì)胞增殖。
　　結(jié)論:
　　1.成功建立大鼠缺血再灌注損傷模型。
　　2.西羅莫司在缺血再灌注損傷中其抗增殖作用阻礙了腎小管上皮細(xì)胞的移行、骨架重建等修復(fù)