天然化合物維康醇活化ROS-Bax依賴途徑誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分
　　目的：
　　盡管醫(yī)學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展,激素抵抗型前列腺癌(CRPC)的治療仍然是臨床治療上面臨的一大難題。CRPC的臨床治療目前可供選擇的方法有限。雖然現(xiàn)有的化療藥物存在許多不足之處,但是化療仍然是CRPC的一線治療方法。目前急需開(kāi)發(fā)新的CRPC化療藥物。在本研究中,我們將從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)、體外實(shí)驗(yàn)兩方面對(duì)天然化合物維康醇的抗前列腺癌作用進(jìn)行評(píng)估,并在此基礎(chǔ)上,運(yùn)用具有CRPC特性的前列腺癌細(xì)胞系模擬CRPC的生物學(xué)過(guò)程

2、,進(jìn)一步研究維康醇的藥理作用機(jī)制。
　　材料和方法：
　　我們選取了包括正常前列腺細(xì)胞、前列腺增生細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞在內(nèi)的七種前列腺細(xì)胞系RWPE-1、LNCaP、C4-2、DU145、PC-3、BPH1和22RV1。通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞死亡。通過(guò)免疫組化、Westernblot分析、流式細(xì)胞學(xué)分析、免疫共沉淀分析(IP)、DNA片段分析、JC-1染色分析和熒光分析檢測(cè)各細(xì)胞信號(hào)通路標(biāo)志物。建立PC-3和DU145細(xì)胞裸鼠

3、皮下移植瘤模型,從動(dòng)物水平評(píng)估維康醇的抗前列腺癌作用。
　　結(jié)果：
　　維康醇誘導(dǎo)細(xì)胞死亡呈時(shí)間依賴性改變,且對(duì)腫瘤細(xì)胞具有相對(duì)的選擇性。通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),維康醇可以造成細(xì)胞線粒體膜電位極化異常,線粒體細(xì)胞色素C向細(xì)胞漿釋放,caspase-3、caspase-9和PARP活化,DNA出現(xiàn)碎裂,這些證據(jù)表明,維康醇誘導(dǎo)細(xì)胞死亡通過(guò)典型的細(xì)胞凋亡途徑。Bax在維康醇處理后出現(xiàn)切割帶。通過(guò)特異性siRNA下調(diào)Bax表達(dá)或者使用Bax

4、通道特異性阻斷劑可以有效地抑制維康醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,這些證據(jù)表明Bax活化參與了維康醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。隨后,我們發(fā)現(xiàn)維康醇可以引起細(xì)胞活性氧(ROS)水平升高,且這一過(guò)程幾乎可以被N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)完全阻斷,同時(shí),NAC也可以阻斷維康醇誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體膜電位極化異常,線粒體細(xì)胞色素C向細(xì)胞漿釋放,caspase-3、caspase-9和PARP活化,DNA碎裂。這些證據(jù)表明NAC阻斷了維康醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明

5、維康醇能夠抑制PC-3細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)并造成移植瘤細(xì)胞凋亡,而DU145細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤未觀察到這一現(xiàn)象。
　　結(jié)論：
　　這些數(shù)據(jù)表明維康醇能夠升高細(xì)胞ROS水平,并通過(guò)活化Bax依賴性內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡。當(dāng)然,要實(shí)現(xiàn)維康醇的臨床應(yīng)用還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。
　　第二部分
　　目的：
　　陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是中老年男性勃起功能障礙(ED)的重要原因。補(bǔ)充V

6、EGF可以通過(guò)多種機(jī)制達(dá)到改善陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞功能的目的。因此,增加VEGF的表達(dá)有望對(duì)ED起到改善作用。研究利用小分子RNA激活人陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞VEGF基因表達(dá),以探討RNA激活技術(shù)治療勃起功能障礙的可行性。
　　材料和方法：
　　體外原代分離培養(yǎng)人陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞。利用α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)免疫組織化學(xué)染色對(duì)人陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞進(jìn)行鑒定。化學(xué)合成針對(duì)人VEGF基因啟動(dòng)子的dsRNA序列

7、(dsVEGF-706)和陰性對(duì)照dsRNA序列。分別用dsVEGF-706和陰性對(duì)照dsRNA轉(zhuǎn)染人陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞,并設(shè)立空白對(duì)照。利用realtimePCR在mRNA水平上對(duì)人陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞VEGF表達(dá)進(jìn)行檢測(cè);利用westernblot和免疫熒光分析在蛋白質(zhì)水平上對(duì)人陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞VEGF表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　轉(zhuǎn)染72小時(shí)后,realtimePCR檢測(cè)顯示dsVEGF-706轉(zhuǎn)染組VEGFm