農(nóng)業(yè)廢物堆肥中木質(zhì)素降解功能微生物群落結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、堆肥化作為一種有效處理農(nóng)業(yè)廢物的方法已經(jīng)得到廣泛的利用，堆肥化過程中有機(jī)質(zhì)是靠堆肥過程中細(xì)菌、真菌、放線菌的共同作用來完成。堆肥過程中的微生物組成與堆肥過程中的有機(jī)質(zhì)相互影響，相互作用，成為影響堆肥進(jìn)程的重要因素。木質(zhì)纖維素是農(nóng)業(yè)有機(jī)廢物中的主要難降解有機(jī)廢物，木質(zhì)素由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不易水解，并且細(xì)胞壁中的纖維素和半纖維素受到木質(zhì)素的保護(hù)，以及木質(zhì)素是腐殖質(zhì)的前體物質(zhì)，因此木質(zhì)素的生物降解成為堆肥過程的限速環(huán)節(jié)。漆酶是木質(zhì)素降解的三大功

2、能酶之一，可以有效的催化氧化各種酚類以及非酚類底物，并在堆肥木質(zhì)素生物降解以及腐熟進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。
　　本研究利用典型農(nóng)業(yè)廢物以及森林表層土壤對農(nóng)業(yè)廢物堆肥進(jìn)行模擬，采用含有愈創(chuàng)木酚以及放線酮抗生素的篩選培養(yǎng)基，從堆肥高溫期第4天樣品中分離得到一株高產(chǎn)漆酶菌株C1，對其鑒定，分析其產(chǎn)酶特性以及環(huán)境有機(jī)染料的降解。結(jié)果表明，通過對菌株的培養(yǎng)特征，形態(tài)特征顯微鏡觀察以及16Sr RNA序列分析，該菌株鑒定為鏈霉菌，命名為Strep

3、tomyces sp.C1。對Streptomyces sp.C1液體發(fā)酵所產(chǎn)的漆酶SCLAC經(jīng)過膜過濾、硫酸銨沉淀、DEAE-52纖維素色譜柱、Sephadex G-100凝膠柱純化后，漆酶比活力提高到24.42 U·mg-1，純化倍數(shù)為25.7，回收率3.45％。通過SDS-PAGE電泳圖表示，純化后的漆酶分子量較小，約為38kDa。根據(jù)純化蛋白質(zhì)測得的氮端氨基酸序列和較小分子量，該漆酶很可能為新型的 two-domain漆酶。SC

4、LAC最適宜反應(yīng)pH值分別為7.0（2,6-DMP）和8.0（ABTS和愈創(chuàng)木酚），最適宜的反應(yīng)溫度為40℃。該漆酶SCLAC具有一定的耐堿性和耐熱性，在pH10.0的緩沖液中培育24h，或在50℃條件下保溫120 min，剩余酶活仍在60%以上。濃度僅為1mM的DDC和NaN3以及濃度為20mM的抑制劑EDTA能完全抑制漆酶的酶活性。酶活能被某些低濃度的金屬離子激活如Cu2+, Co2+和Fe3+，除Cu2+外，高濃度的金屬離子都會抑

5、制酶活。漆酶SCLAC對 ABTS的 Km值最小，約為0.43mM, kcat/Km達(dá)到了1.76×104 M-1 s-1，表明與ABTS結(jié)合的最為緊密。SCLAC對環(huán)境污染物的降解時發(fā)現(xiàn)，在小分子介體丁香醛連氮存在的情況下，漆酶SCLAC對染料靛紅和鉆石黑具有較好的降解效果。結(jié)果表明，從堆肥代表時期樣品中能分離得到表達(dá)量高、熱穩(wěn)定性較好的漆酶，為進(jìn)一步研究堆肥環(huán)境中木質(zhì)素降解微生物的重要功能基因提供了借鑒作用，具有重要的理論意義和應(yīng)用

6、前景。
　　越來越多的研究致力于采用13C固體核磁共振波譜法（solid13C-NMR）表征堆肥以及土壤樣品中有機(jī)質(zhì)的動態(tài)變化過程，堆肥過程中的有機(jī)質(zhì)的變化與微生物的種群組成及動態(tài)變化相互影響，不同有機(jī)質(zhì)的對細(xì)菌和真菌的種群組成的影響大小不同。在本研究中，采用PCR-DGGE分析了堆肥期間細(xì)菌及真菌微生物群落結(jié)構(gòu)變化，13C NMR分析堆肥過程中參與碳化學(xué)的變化，并采用冗余分析 RDA研究殘余碳化學(xué)對細(xì)菌和真菌微生物群落變化的影響

7、。結(jié)果表明，顯著影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的因子為C/N、芳香基碳Aryl-C、pH值和氧烷基類碳O-alkyl-C（P<0.05），對于真菌群落結(jié)構(gòu)而言，顯著因子為WSC、Di-O-alkyl-C、N-alkyl-C以及堆體溫度（P<0.05）。芳香基碳Aryl-C與細(xì)菌群落的相互影響，表示堆肥過程中的細(xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu)參與堆肥木質(zhì)素生物降解。結(jié)果表明，殘余碳化學(xué)變化與堆肥微生物種群結(jié)構(gòu)相互作用，為進(jìn)一步理解堆肥過程中可利用有機(jī)碳與微生物群落結(jié)

8、構(gòu)提供了理論參考。
　　傳統(tǒng)的細(xì)菌和真菌three-domain漆酶基因結(jié)構(gòu)及多樣性已經(jīng)有了較為深入的研究，而最新的研究發(fā)現(xiàn)，two-domain漆酶是比一般的漆酶基因氨基酸殘基少，分子量小的新型漆酶。這類漆酶被認(rèn)為廣泛存在于鏈霉菌屬中，鏈霉菌屬為堆肥過程中的優(yōu)勢放線菌，鏈霉菌屬漆酶具有熱穩(wěn)定性好、耐堿性以及作用底物范圍廣等優(yōu)勢。本研究為了評價鏈霉菌屬two-domain漆酶基因多樣性及分布，從而進(jìn)行鏈霉菌屬漆酶基因的相關(guān)木質(zhì)素降

9、解及產(chǎn)酚氧化酶活功能分析。本研究根據(jù)鏈霉菌屬two-domain漆酶基因的保守氨基酸及其cDNA序列，設(shè)計了針對于多銅結(jié)合2區(qū)和4區(qū)之間擴(kuò)增鏈霉菌two-domain漆酶基因的特異性引物對Cu2SF/Cu4SR?？寺∥膸旆治霰砻?，堆肥期間的鏈霉菌two-domain漆酶基因多樣性較高，以及處于不斷的動態(tài)變化之中。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，堆肥中的鏈霉菌屬two-domain漆酶主要與天藍(lán)色鏈霉菌Streptomyces coelicolor、紫

10、黑鏈霉菌Streptomyces violaceusniger、灰色鏈霉菌Streptomyces griseus以及甘薯鏈霉菌的two-domain漆酶基因聚類。測得的序列共分為8個進(jìn)化枝，大多數(shù)與已知的鏈霉菌two-domain漆酶基因聚類，但是分枝III和VIII未與已知鏈霉菌two-domain漆酶基因序列聚類。此外，堿性條件下（pH8.0）測得堆肥期間酚氧化酶活變化與鏈霉菌屬two-domain漆酶基因數(shù)量顯著正相關(guān)（R2=0

11、.830，P=0.012），但酸性條件下測得的酶活卻不顯著相關(guān)。鏈霉菌屬two-domain漆酶基因數(shù)量與半纖維素降解率線性顯著正相關(guān)（R2=0.651，P=0.05），與纖維素和木質(zhì)素降解率正相關(guān)（R2=0.484和R2=0.466）。結(jié)果表明，堆肥鏈霉菌屬微生物很可能參與酚氧化酶活的產(chǎn)生以及木質(zhì)纖維素降解相關(guān)功能，鏈霉菌屬two-domain漆酶基因多樣性的相關(guān)研究對于拓展漆酶基因的分子生物學(xué)發(fā)展及其環(huán)境應(yīng)用具有十分重要意義。

12、>　　傳統(tǒng)的研究認(rèn)為真菌對堆肥中的木質(zhì)素降解發(fā)揮主要作用，最近的研究發(fā)現(xiàn)，許多細(xì)菌也能產(chǎn)生漆酶，對木質(zhì)素發(fā)生溶解作用，而且細(xì)菌漆酶具有耐堿性及耐熱性等有利特性，這些特性使得細(xì)菌在高溫及弱堿性的堆肥環(huán)境中具有優(yōu)勢，因此推測堆肥中的細(xì)菌種群同樣對堆肥中的木質(zhì)纖維素的降解發(fā)揮關(guān)鍵作用。并且針對于堆肥期間漆酶細(xì)菌多樣性，分布以及其相關(guān)功能的研究還比較少。采用細(xì)菌漆酶通用引物Cu1AF/Cu2R，對堆肥期間代表時期樣品（D1，D4，D8，D15，

13、D30，D50）的細(xì)菌漆酶基因進(jìn)行擴(kuò)增。共建立6個克隆文庫，得到189條有效序列，共劃分為59個OTUs（10%遺傳進(jìn)化距離）。堆肥期細(xì)菌漆酶香農(nóng)指數(shù)在第4天高溫期達(dá)到最大值，為3.42，表明堆肥高溫期的細(xì)菌物種種群較為豐富。克隆測序所得到的189個序列與已知細(xì)菌漆酶基因共同建立的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，α變形菌門α-proteobacteria，γ變形菌門γ-proteobacteria，放線菌門或厚壁菌門Actinobacteria/Fir

14、micutes占序列總數(shù)的71.89%，在選取的6個克隆文庫中，為堆肥期間的細(xì)菌漆酶基因的優(yōu)勢種群。皮爾森Pearson相關(guān)分析表示，堆體溫度和WSC含量與細(xì)菌漆酶基因數(shù)量，Chao1豐富度指數(shù)，香農(nóng)指數(shù)正相關(guān)。RDA相關(guān)性分析表示，在選取的環(huán)境因子中，富里酸對堆肥期間細(xì)菌漆酶基因分布影響最大。結(jié)果表示，細(xì)菌漆酶基因數(shù)量，多樣性指數(shù)以及分布結(jié)構(gòu)與堆肥中環(huán)境因子變化相互影響，堆肥過程中的環(huán)境因子的變化是推動和形成堆肥過程細(xì)菌漆酶群落結(jié)構(gòu)的