循環(huán)RNA檢測(cè)及對(duì)胃癌診療的意義.pdf

1、目的：建立微量核酸的巢式定量PCR檢測(cè)技術(shù)，并運(yùn)用該技術(shù)檢測(cè)血漿或培養(yǎng)細(xì)胞上清中細(xì)胞外循環(huán)RNA分子。通過(guò)創(chuàng)建細(xì)胞饑餓、缺氧、低溫、藥物干預(yù)等模型探討循環(huán)RNA在腫瘤患者異常增高的原因及其對(duì)臨床胃癌診斷、治療的意義。 方法：聯(lián)合運(yùn)用Trizol試劑與離心吸附柱方法提取血漿或培養(yǎng)細(xì)胞上清中微量循環(huán)RNA，建立基于SYBR green Ⅰ的巢式定量PCR檢測(cè)微量RNA的技術(shù)。探討體外胃癌細(xì)胞株(SGC7901)經(jīng)血清饑餓、缺氧、低溫

2、培養(yǎng)后，上清細(xì)胞外RNA的變化規(guī)律，以此初步分析腫瘤患者循環(huán)RNA異常增高的原因。細(xì)胞經(jīng)5-氟尿嘧啶、順鉑作用后，定時(shí)觀察培養(yǎng)上清RNA的變化，以此推斷循環(huán)RNA對(duì)腫瘤患者化療的監(jiān)測(cè)價(jià)值。同時(shí)分別對(duì)胞內(nèi)與胞外β-actin基因相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行比較。通過(guò)過(guò)濾實(shí)驗(yàn)及RNase抵抗實(shí)驗(yàn)判斷循環(huán)RNA對(duì)RNase的抵抗力，初步分析其可能的一些生物學(xué)性質(zhì)。體內(nèi)聯(lián)合檢測(cè)手術(shù)前和手術(shù)后的胃癌患者及健康人外周血循環(huán)CXCR4和Bmi-1基因表達(dá)水平以及

3、血漿CEA、CA19-9含量，結(jié)合胃癌患者臨床資料研究其對(duì)胃癌診斷、治療的意義。 結(jié)果：聯(lián)合運(yùn)用Trizol-離心柱技術(shù)成功分離出血漿循環(huán)RNA分子，巢式定量PCR檢測(cè)微量RNA線性良好，且敏感性達(dá)到100～1copies/μl。SGC細(xì)胞經(jīng)血清饑餓、低溫處理后一定時(shí)期內(nèi)上清RNA較對(duì)照組顯著降低，而缺氧組細(xì)胞上清RNA含量在48小時(shí)后較對(duì)照組明顯升高。腫瘤細(xì)胞經(jīng)抗瘤藥作用48小時(shí)后，大部分細(xì)胞死亡，上清RNA含量略上升但不明顯

4、，剩余細(xì)胞經(jīng)反復(fù)換液徹底移去殘留藥物后，上清RNA含量較藥物作用前及對(duì)照組均顯著降低。同等量的胞內(nèi)與胞外RNA經(jīng)同步逆轉(zhuǎn)錄PCR后，β-actin胞外表達(dá)水平顯著低于胞內(nèi)表達(dá)水平。培養(yǎng)細(xì)胞上清經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后濾液RNA含量顯著低于過(guò)濾前及粘附于濾膜上的RNA含量，濾液、濾膜及濾前上清RNA均能抵抗RNase的降解而提純游離的SGC胞內(nèi)RNA經(jīng)RNase作用后被完全降解。胃癌患者外周血漿循環(huán)CXCR4、Bmi-1基因及CEA、CA

5、19-9蛋白表達(dá)顯著高于健康人?；颊呓?jīng)手術(shù)后表達(dá)下降。血漿CXCR4、Bmi-1表達(dá)與患者年齡、分期、分化程度、是否轉(zhuǎn)移等因素有關(guān)?；虻穆?lián)合檢測(cè)能有效提高診斷的敏感性和準(zhǔn)確率，且診斷價(jià)值優(yōu)于CEA、CA19-9的組合。 結(jié)論：巢式熒光定量PCR是一種敏感的檢測(cè)微量核酸的方法。缺氧與較高的代謝水平是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞釋放循環(huán)RNA增加的重要原因。循環(huán)RNA對(duì)RNase有一定的抵抗力。外周血循環(huán)RNA腫瘤相關(guān)基因的檢測(cè)對(duì)腫瘤的診斷及治療