柞蠶Iflavirus病毒的基因組測序、分析及其傳播途徑.pdf

1、柞蠶（Antheraea pernyi）是我國一種重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，也是一種重要的基礎(chǔ)生命科學(xué)研究對象。在野外生長的柞蠶遭受著各種病害的侵襲，其中柞蠶吐白水病是一種危害嚴(yán)重的病毒病，它給我國的柞蠶飼養(yǎng)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究發(fā)現(xiàn)了一株新的柞蠶小RNA病毒，通過病毒注射試驗，證明了該病毒是柞蠶吐白水病的病原生物，這將對柞蠶吐白水病的診斷與防治產(chǎn)生重要的影響。本文的主要內(nèi)容和研究結(jié)論如下:
　　(1)通過蔗糖密度梯度離心，在患得吐

2、白水病的柞蠶幼蟲、柞蠶蛹體內(nèi)分離得到了一株新的正義單鏈RNA病毒。被該病毒侵染健康柞蠶幼蟲，會表現(xiàn)出明顯的柞蠶吐白水病的癥狀。因此根據(jù)柯赫氏法則，推斷該病毒為柞蠶吐白水病的病原生物。
　　(2)驗證了柞蠶Iflavirus病毒的基因組含有10163個核苷酸，具有兩段非編碼區(qū)、一個開放性閱讀框以及一個天然的poly-A尾巴。該病毒的開放性閱讀框能夠編碼一條含有3036個氨基酸的多聚肽鏈，四個病毒蛋白位于肽鏈的N端(Viral pro

3、tein1-4)，三個功能蛋白位于肽鏈的C端（其中包括含有解旋酶結(jié)構(gòu)域的2C蛋白、含有半胱氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域的3C蛋白和含有RNA依賴性的RNA合成酶結(jié)構(gòu)域3D蛋白）。對該病毒基因組結(jié)構(gòu)、氨基酸序列和進(jìn)化樹的分析結(jié)果都表明，這個病毒是Iflavirus病毒屬的一株新生物，因此將其命名為柞蠶Iflavirus病毒(Antheraea pernyi Iflavirus，ApIV)。
　　(3)利用Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)，在Sf9細(xì)

4、胞內(nèi)表達(dá)了帶有組氨酸標(biāo)簽的柞蠶Iflavirus病毒2C蛋白，經(jīng)過親和層析的方法純化后，得到了大量的、高純度的重組蛋白。經(jīng)實驗檢測，柞蠶Iflavirus病毒2C蛋白具有NTPase活性，能夠水解ATP/UTP/CTP/GTP，釋放磷酸根離子，對四種NTPs的水解能力由高至低依次為ATP＞GTP＞UTP＞CTP。柞蠶Iflavirus病毒解旋酶的最適反應(yīng)體系為50 mM Tris-HCl(pH8.0)，2 mM MgCl2，50 mMN

5、aCl，1 mM ATP，反應(yīng)溫度為37℃。柞蠶Iflavirus病毒2C蛋白具有DNA解旋酶活性，能夠以DNA-DNA雙鏈為底物發(fā)生解旋反應(yīng)，解旋方向為3'到5'方向。
　　(4)進(jìn)行了柞蠶幼蟲、蛹、蛾的實驗室感染試驗，并使用RT-PCR、Western Blot等方法檢測了柞蠶Iflavirus病毒在昆蟲體內(nèi)及受精卵中的復(fù)制情況。實驗證明，在經(jīng)口接種或注射接種柞蠶Iflavirus病毒的幼蟲、蛹、蛾體內(nèi)，可以明顯的檢測到該病毒