患病新生兒TORCH感染篩查方法及基因多態(tài)性關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、目的：應(yīng)用巢式聚合酶鏈反應(yīng)(N-PCR)、酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme Linked Inmonosorbent Assay ELISA)、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)檢測方法，從新生兒的外周血出發(fā)，一方面，提取其血清中的病毒DNA用于TORCH感染篩查，另一方面，提取血細(xì)胞基因組DNA進(jìn)行基因多態(tài)性研究。探索ELISA與巢式PCR關(guān)聯(lián)性、巢式PCR與熒光定量PCR關(guān)聯(lián)性、ELISA與熒光定量PCR關(guān)聯(lián)性，研究三種方法的檢出率、

2、靈敏度、特異性、可靠性和重復(fù)性，然后對檢測方法進(jìn)行鑒定及合理性的綜合評價，同時，探討巢式聚合式酶聯(lián)反應(yīng)方法檢測新生兒病原體感染的臨床應(yīng)用價值。通過聚合式酶聯(lián)反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)，觀察出生缺陷新生兒特異性等位基因的頻率，探測其基因的易感性。研究基因多態(tài)性與TORCH感染之間、基因多態(tài)性與出生缺陷病種之間、TORCH感染與出生缺陷病種之間的相關(guān)聯(lián)性。 方法：采用酚抽取乙醇沉淀與加熱裂解法結(jié)合提取新生兒外周血

3、血清中的DNA，異硫氰酸胍法提取新生兒外周血血清中的RNA后，通過兩對引物，一對擴(kuò)增較大DNA片段的“外”引物和一對在擴(kuò)增產(chǎn)物中再擴(kuò)增小片段的“內(nèi)”引物。采用巢式聚合式酶聯(lián)反應(yīng)法，分別針對TORCH病毒DNA和RNA高度保守區(qū)設(shè)計引物并擴(kuò)增其病毒DNA及RNA，篩查這些病毒在出生缺陷兒的感染情況；采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測新生兒血清中的IgG、IgM；采用熒光定量PCR篩查TORCH感染狀況，以達(dá)到對原始模板量定量的目的；此外，用酚抽取乙醇

4、沉淀法提取新生兒外周血細(xì)胞基因組DNA，用于PCR-RFLP新生兒TORCH感染基因分型。 結(jié)果巢式聚合式酶聯(lián)反應(yīng)檢測方法檢測新生兒TORCH感染：早產(chǎn)兒組HCMV、HBV、HSV-2、CVB3感染率分別為63.9％、9.8％、6.6％、23.8％；低出生體重兒組HCMV、TOX、HBV、HSV-2、CVB3感染率分別為62.3％，6.6％、11.5％、11.5％、23％；呼吸系統(tǒng)疾病患兒組HCMV、CVB3感染率分別為61.8

5、％、26.7％；黃疸患兒組HCMV，HSV-2，CVB3；感染率分別為56.3％，12.5％、29.2％；先天性心臟病患兒組HBV，CVB3感染率分別為27.3％、27.3％，這五種疾病組病原體感染率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。新生兒TORCH感染這五種疾病組病原體檢測總體比較，7種病原體陽性感染率，病例組感染明顯高于對照組。酶聯(lián)免疫吸附法與巢式聚合酶鏈反應(yīng)檢測方法檢測新生兒TORCH感染相比：酶聯(lián)免疫吸附法相對巢式

6、聚合式酶鏈反應(yīng)檢測方法檢出率、靈敏度、特異性較低。實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)方法檢測新生兒TORCH感染情況：實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢出陽性樣本率為0，而巢式聚合酶鏈反應(yīng)檢出陽性樣本率為86.67％，即巢式聚合酶鏈反應(yīng)檢出率高于熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。TORCH與基因多態(tài)性關(guān)聯(lián)研究：TAP1等位基因Godon 637位點，HCMV感染，黃疸、早產(chǎn)兒、低體重兒三種疾病組，基因表現(xiàn)型頻率差異有顯著性(P<0.

7、05)。結(jié)論巢式聚合酶鏈反應(yīng)法與酶聯(lián)免疫吸附法及熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)比較，其檢出率、靈敏度、特異性較高，可提高篩查的陽性率，減少漏查。對加強(qiáng)母孕期的預(yù)防也是有益的，特別是孕期前三個月，胎盤屏障尚未發(fā)育完善，預(yù)防各種病毒感染，提高免疫力在這個時期是至關(guān)重要的，同時也促進(jìn)提高優(yōu)生優(yōu)育的質(zhì)量。巢式聚合酶鏈反應(yīng)是一種簡單、有效、經(jīng)濟(jì)可靠的技術(shù)方法，便于臨床上的選擇和應(yīng)用，為臨床新生兒病原體篩查提供了一種檢測手段。TORCH與基因多態(tài)性關(guān)聯(lián)研究發(fā)