可注射性纖維蛋白凝膠-脫鈣骨基質(zhì)復合支架修復兔膝關節(jié)軟骨的實驗研究.pdf

1、骨性關節(jié)炎是臨床上常見的一種關節(jié)炎，其發(fā)病與增齡、外傷和力的承受、肥胖、遺傳以及性別等有關。病理改變表現(xiàn)為軟骨的破壞和修復并存，關節(jié)囊增厚，病變骨質(zhì)粘連，滑膜炎血管增厚和局灶性出血以及關節(jié)附近骨質(zhì)囊性變。關節(jié)機械力分布失衡、負荷過度后，出現(xiàn)軟骨磨損及軟骨細胞代謝異常，軟骨細胞釋放溶酶體和膠原蛋白酶，導致膠原蛋白網(wǎng)斷裂。軟骨破壞的同時也伴有修復過程，但由于新合成的細胞外基質(zhì)異常，新合成的軟骨很快降解破壞，滑膜產(chǎn)生的炎癥因子反過來加速軟骨的

2、破壞，如此反復循環(huán)，軟骨消耗殆盡，臨床上出現(xiàn)骨性關節(jié)炎的癥狀。
　　 由于關節(jié)軟骨無血運、無神經(jīng)支配、無淋巴管，軟骨細胞為終末分化細胞，軟骨細胞被包裹在軟骨陷窩內(nèi)限制了軟骨細胞的遷移，同時滑膜細胞數(shù)量少、生物活性有限，因此，軟骨一旦損傷后修復能力極低，甚至被認為是不能再生的組織(Hunter,1743)。目前的研究表明，在特定的條件及環(huán)境中，軟骨修復是可以實現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)若軟骨缺損的撕裂部位靠近軟骨下骨或骨髓，引起血管出血，則軟

3、骨修復再生即可發(fā)生。出血導致血腫和纖維蛋白凝塊形成，并進一步促進與骨發(fā)生有關的細胞因子及蛋白的聚集。接下來的2-5天內(nèi)，諸如間充質(zhì)干細胞、成纖維細胞等祖細胞從周圍的軟骨、骨、骨髓、滑膜等組織向受損初遷移來維持軟骨修復。其后的一周，血凝塊的纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)成為干細胞的支架，充填缺損部位。
　　 自從1965年Smith成功分離培養(yǎng)軟骨細胞以后，以體外支架培養(yǎng)軟骨種子細胞后移植體內(nèi)為特點的軟骨組織工程的研究便逐漸開展。1987年美國

4、科學基金會在華盛頓舉辦的生物工程小組會上提出了“組織工程”這個名詞，1988年被定義為“應用生命科學與工程科學的原理和方法，在可控、可重復的條件下，通過哺乳動物、人類(包括患者本身)特定細胞在網(wǎng)絡構(gòu)架上的體外培養(yǎng)及體內(nèi)移植，形成具有特定功能的組織和生物替代物”。特別是最近10余年，軟骨組織工程取得長足進步并逐漸顯示其修復軟骨缺損的優(yōu)越性。
　　 生物工程支架必須具備以下屬性：可降解、生物相容性、表面積/體積比、機械強度以及神經(jīng)、

5、血管可滲透性。骨軟骨組織工程支架還需具備一定的機械強度，并能夠釋放促進骨與軟骨再生的活性物質(zhì)。同樣的，作為種子細胞貼附、遷移以及分化基礎的相互交聯(lián)的微孔樣結(jié)構(gòu)也是支架不可或缺的評價指標。目前的生物載體材料中的天然材料主要包括膠原和纖維蛋白凝膠。纖維蛋白凝膠及脫鈣骨基質(zhì)都有優(yōu)良的生物相容性及生物降解性，因此可以作為軟骨組織工程支架培養(yǎng)軟骨種子細胞。這兩種材料分別可以作為生長因子的載體緩慢釋放生長因子，并達到持續(xù)發(fā)揮促軟骨細胞生長的功能。<

6、br>　　 纖維蛋白凝膠以及脫鈣骨基質(zhì)均具備作為支架材料培養(yǎng)軟骨種子細胞的基本條件，生物相容性、可降解性等均較好，而且具備作為生長因子載體緩慢保存并緩慢釋放的功能。纖維蛋白凝膠具有較大的表面積/體積比，孔隙率較大，一方面通過較大附著面積促進軟骨細胞的增殖、分化，另一方面促進營養(yǎng)物質(zhì)在支架與周圍組織的細胞間運輸。通過加入氨甲環(huán)酸減慢其降解速度，達到材料的降解和軟骨組織的形成同步化。并有DBM在降解同時緩慢釋放其成軟骨活性物質(zhì)，促進了軟骨

7、組織的形成。
　　 目的：本實驗研究了纖維蛋白凝膠/脫鈣骨基質(zhì)復合支架作為軟骨組織工程支架的可行性及有效性。并且進一步研究了該種復合支架能否作為可注射性復合支架修復關節(jié)軟骨損傷。
　　 方法：
　　 1.分離并提取兔膝關節(jié)軟骨細胞，進行細胞培養(yǎng)與傳代。
　　 2.取第三代軟骨細胞接種于復合支架體外培養(yǎng)四周。
　　 3.移植復合支架/軟骨細胞至兔膝關節(jié)髁間窩軟骨缺損處，分別于第4周、第8周以及第12

8、周取材。
　　 4.制作兔膝關節(jié)骨關節(jié)炎模型。
　　 5.大體觀察修復情況。
　　 6.標本切片HE染色。
　　 7.Masson染色。
　　 8.Ⅱ型膠原免疫組化染色。
　　 9.Wakitani評分，觀察其體內(nèi)修復關節(jié)缺損效果。
　　 10.向切除了前交叉韌帶及半月板的兔膝關節(jié)內(nèi)注射復合支架/軟骨細胞。并于第12周取材。
　　 11.制定新的綜合評分標準，評估骨性關節(jié)炎

9、組織學改變。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功提取軟骨細胞并進行傳代培養(yǎng)。
　　 2.成功制作兔膝關節(jié)骨關節(jié)炎模型。
　　 3.軟骨細胞在復合支架中呈球狀，并在DBM微粒周圍更多分布。
　　 4.透明軟骨樣組織從支架移植修復第4周開始充填缺損部，并在第12周可見到修復組織與周圍正常軟骨組織無異，表面光滑，顏色半透明。光鏡下于第8周可見明顯軟骨陷窩，第12周時，Ⅱ型膠原明顯多于第4、8周。