畢赤酵母角蛋白酶基因工程菌產(chǎn)酶培養(yǎng)基適宜碳源選擇及重組酶在生長(zhǎng)豬上的應(yīng)用研究.pdf

1、本文通過(guò)三個(gè)試驗(yàn)研究了由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的角蛋白酶基因工程菌(P.pastoripPICZaA-kerAopti1)的適宜發(fā)酵培養(yǎng)基碳源、重組酶的酶學(xué)性質(zhì)、重組酶對(duì)羽毛粉的體外酶解效果及在生長(zhǎng)豬上的應(yīng)用效果，為該酶的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　試驗(yàn)一:畢赤酵母基因工程菌產(chǎn)酶培養(yǎng)基適宜碳源及重組酶酶學(xué)性質(zhì)分析
　　為進(jìn)一步提高角蛋白酶基因工程菌(P.pastori pPICZaA-kerAopti1)的分泌水平，降低生產(chǎn)成本，本

2、試驗(yàn)采用30 L發(fā)酵罐對(duì)該基因工程菌進(jìn)行小規(guī)模誘導(dǎo)發(fā)酵，比較葡萄糖和甘油兩種不同碳源的產(chǎn)酶效果。結(jié)果顯示，采用葡萄糖作為培養(yǎng)基碳源時(shí)，最高酶活可達(dá)568 U/mL，優(yōu)于甘油作為碳源的效果，并且與搖瓶水平相比提高了150％以上。酶學(xué)性質(zhì)分析結(jié)果顯示，重組角蛋白酶(PK)分子大小為39 kDa左右，該酶的最適反應(yīng)pH為7.5，最適反應(yīng)溫度為50℃;該酶在50℃時(shí)熱穩(wěn)定性較好，保溫30min后酶活幾乎沒(méi)有損失，但60℃時(shí)熱穩(wěn)定性不佳;PK對(duì)羽

3、毛粉的降解能力優(yōu)于天青角蛋白。
　　試驗(yàn)二:重組酶對(duì)羽毛粉的體外酶解效果
　　為了分析PK對(duì)羽毛粉的水解能力，本試驗(yàn)在體外用PK和胃蛋白酶-胰蛋白酶對(duì)羽毛粉進(jìn)行水解。結(jié)果顯示，只用PK處理時(shí)，羽毛粉水解率為14.9％，顯著高于空白組和用胃蛋白酶-胰蛋白酶處理的水解率，酶解上清液可溶蛋白含量達(dá)到0.15g/L，顯著高于胃蛋白酶-胰蛋白酶組，大部分必需氨基酸含量也顯著高于胃蛋白酶-胰蛋白酶組。當(dāng)羽毛粉先用PK處理，再用胃蛋白酶-

4、胰蛋白酶處理，羽毛粉的水解率達(dá)到16.56％，上清液可溶蛋白含量顯著提高，達(dá)到0.28g/L，豬所需必需氨基酸含量均顯著提高（p＜0.05)。
　　試驗(yàn)三:重組酶在生長(zhǎng)豬上的應(yīng)用效果
　　本試驗(yàn)考察PK在生長(zhǎng)豬上的應(yīng)用效果。選用了60頭初始體重為58.1±1.1kg的DLY生長(zhǎng)豬，隨機(jī)分成5個(gè)處理，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)2頭豬。處理組1作為正對(duì)照組（玉米豆粕型基礎(chǔ)日糧）;處理2-5，以羽毛粉(5％)等氮替代處理1中的豆粕

5、，同時(shí)賴氨酸及粗蛋白的含量保證一致，PK的添加量分別為0、3000 U/kg、6000 U/kg、9000 U/kg。試驗(yàn)期為14天，考察生長(zhǎng)豬的生長(zhǎng)性能、養(yǎng)分消化率、腸道菌群和血清生化指標(biāo)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，處理2的ADG顯著降低（0.890±0.056 kgvs.0.717±0.053 kg，P＜0.05），大部分必需氨基酸表觀消化率均顯著下降。添加PK后，生長(zhǎng)豬 ADG顯著提高，并具有劑量效應(yīng)。與對(duì)照組相比，添加9000U/

6、kg組ADG只降低了2.2％(P＞0.05）。隨著PK添加量的增加，氨基酸表觀消化率也隨之增加。PK的添加還顯著提高干物質(zhì)、能量、磷和有機(jī)物的表觀消化率(P＜0.05）。直腸菌群的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PK能顯著提高腸道乳酸桿菌的含量，顯著降低腸道大腸桿菌的含量(P＜0.05）。試驗(yàn)期間，采食量與料肉比在各處理組間無(wú)差異(P＞0.05）。
　　綜上結(jié)果表明，本研究成功實(shí)現(xiàn)了基因工程菌(P.pastoris pPICZαA-kerAwt)的