DNMT1和CLM-3在天然免疫應(yīng)答中的功能及機(jī)制研究.pdf

1、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶是一種在原核和真核生物高度保守的酶，能夠在基因組中的DNA復(fù)制后對(duì)其胞嘧啶C5位點(diǎn)進(jìn)行修飾，參與體內(nèi)多種重要生理過程，主要包括:調(diào)節(jié)基因表達(dá)、基因印記、維持染色體完整性以及X-染色體滅活等。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能的不同，哺乳動(dòng)物中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(Dnmts)主要分為兩大類:DNA甲基化維持酶Dnmt1以及DNA從頭甲基化酶Dnmt3a、Dnmt3b和Dnmt3L等.
　　 樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，

2、DC)是指具有樹枝狀突起和星狀多形性，高表達(dá)MHCⅠ類和Ⅰ類分子，能有效攝取、加工和處理抗原并激活初始型T細(xì)胞的一類抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)。DC是1973年由Steinman和Cohn首先發(fā)現(xiàn)的。作為目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的APC，DC最大的特點(diǎn)是能夠刺激初始型T細(xì)胞(naive Tcell)活化和增殖。DC是抗原特異性免疫應(yīng)答的始動(dòng)者，由于其在免疫應(yīng)答中的獨(dú)特地位，對(duì)DC的研究有助于深入了解

3、機(jī)體免疫應(yīng)答的產(chǎn)生和調(diào)控機(jī)制，對(duì)腫瘤、移植排斥、感染、自身免疫性疾病等的發(fā)生發(fā)展機(jī)制的認(rèn)識(shí)有重要的理論意義。
　　 免疫球蛋白超家族含有眾多的膜上和膜內(nèi)受體，參與天然免疫和獲得性免疫中的各種免疫應(yīng)答反應(yīng)，小鼠CMRF-35樣分子家族為免疫球蛋白超家族的成員之一.CLM家族成員在識(shí)別不同的配體后能夠正向或負(fù)向調(diào)控免疫應(yīng)答反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)室通過小鼠樹突狀細(xì)胞cDNA文庫大規(guī)模測序后，發(fā)現(xiàn)了一系列選擇性地在樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等抗原提呈細(xì)

4、胞上表達(dá)的CLM家族成員受體，包括樹突狀細(xì)胞來源的免疫球蛋白受體1(DC-derived Ig receptor1，DIgR1)/CLM-4，樹突狀細(xì)胞來源的免疫球蛋白受體2(DC-derived Ig receptor2，DIgR2)/CLM-1，CLM-5，以及本文中研究的CLM-3。
　　 抗原遞呈細(xì)胞能夠通過模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRR)識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(path

5、ogen-associated molecular patterns，PAMP)來檢測入侵宿主的病原微生物，然后促發(fā)免疫球蛋白超家族含有眾多的膜上和膜內(nèi)受體，參與天然免疫和獲得性免疫中的各種免疫應(yīng)答反應(yīng)?；罨奶烊幻庖呒?xì)胞能夠誘導(dǎo)促炎因子和Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生來清除入侵的病原微生物。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)作為模式識(shí)別受體中最重要的一種，顯著高表達(dá)于抗原遞呈細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞，單核細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞

6、。根據(jù)所有TLRs家族成員的亞細(xì)胞定位，TLRs分成兩大類:細(xì)胞膜定位的TLRs和細(xì)胞內(nèi)定位的TLRs。在所有TLRs中，內(nèi)體定位的TLR9是唯一一種能夠識(shí)別病原體來源DNA的TLR。一旦結(jié)合細(xì)菌中含有CpG島的DNA或者人工合成的含有為甲基化CpG基序的寡聚脫氧核苷酸(CpG-ODN)，TLR9就能夠直接活化抗原遞呈細(xì)胞和天然免疫細(xì)胞分泌各種促炎因子。當(dāng)CpG-ODN結(jié)合到TLR9時(shí)能夠招募接頭分子MyD88，進(jìn)而激活下游MAPKs和

7、NF-κB的磷酸化信號(hào)通路，最終引起促炎因子和Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。研究證實(shí)TLR9的激動(dòng)劑能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈的Th1型免疫反應(yīng)來保護(hù)宿主免受細(xì)菌和病毒的感染。因此，對(duì)于如何選擇性的活化TLR9信號(hào)來起始保護(hù)性免疫應(yīng)答及TLR9完全活化的潛在機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。
　　 基于以上研究進(jìn)展和現(xiàn)狀分析，我們利用現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)技術(shù)對(duì)人單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中的DNMT1在天然免疫應(yīng)答方面的功能進(jìn)行了研究;同時(shí)對(duì)于CLM-3對(duì)于Tol

8、l樣受體的功能影響進(jìn)行了深入的探討。
　　 第一部分人單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞中與DNMT1相互作用蛋白的探討
　　 隨著小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞在免疫應(yīng)答中功能研究的深入，我們開始關(guān)注人單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞的功能。作為重要的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1功能的不斷發(fā)現(xiàn)，使得我們開始探尋DNMT1在人單核細(xì)胞來源樹突狀細(xì)胞中的作用。
　　 我們使用蛋白質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)、質(zhì)譜兼容銀染以及LS-MS/MS的手段，發(fā)現(xiàn)了

9、一系列在人單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞中與DNMT1相互作用的蛋白，這些蛋白主要集中在翻譯起始因子eIF家族，主要包括eIF3A、eIF3H;以及細(xì)胞周期和凋亡調(diào)節(jié)蛋白1(cell cycle and apoptosis regulator protein1,CARP1)。
　　 鑒于目前的研究報(bào)道，DNMT1主要是在核內(nèi)發(fā)揮其對(duì)DNA的甲基化修飾功能，而eIF3A和eIF3H則主要是在胞漿中發(fā)揮蛋白的翻譯。這就促使我們?nèi)ヌ綄NM

10、T1是否在胞漿中也發(fā)揮其非經(jīng)典功能，而參與了其他一些生物學(xué)功能。通過免疫共沉淀，我們發(fā)現(xiàn)了DNMT1確實(shí)存在于胞漿中，而且能夠與同在胞漿中發(fā)揮作用的eIF3A和eIF3H相互結(jié)合，而在胞核中則為發(fā)現(xiàn)eIF3A和eIF3H與DNMT1的結(jié)合。對(duì)于DNMT1在胞漿中具體發(fā)揮怎么樣的功能還有待于進(jìn)一步的深入探討。
　　 對(duì)于同期發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞周期和凋亡調(diào)節(jié)蛋白CARP1，研究發(fā)現(xiàn)DNMT1與CARP1兩者之間主要在細(xì)胞核內(nèi)相互作用，這提示

11、我們CARP1可能參與了DNMT1的經(jīng)典功能，作為一個(gè)新的可能參與DNA甲基化的蛋白，其具體功能有待于進(jìn)一步深入的研究。
　　 第二部分DNMT1在巨噬細(xì)胞天然免疫功能中的作用研究
　　 TLR是研究最早的模式識(shí)別受體，其在激活機(jī)體的固有免疫應(yīng)答和調(diào)控獲得性免疫應(yīng)答，抵御各種病原體感染中發(fā)揮重要的作用。它的活化不足導(dǎo)致機(jī)體不能有效地清除病原體，而過度的激活又會(huì)引發(fā)一系列的免疫損傷如膿毒癥休克等。因此TLR信號(hào)通路必須受到

12、嚴(yán)格的精密調(diào)控，TLR信號(hào)通路同其他信號(hào)通路之間的交叉聯(lián)系也是近年來免疫學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。
　　 對(duì)于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1在TLR信號(hào)通路中的作用還沒有相關(guān)的研究報(bào)道，我們通過干擾小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中的DNMT1后，用各種TLR配體進(jìn)行刺激，進(jìn)而研究DNMT1是否參與TLR信號(hào)通路。研究發(fā)現(xiàn)，在DNMT1得到有效干擾后并不能夠顯著影響TLR3、TLR4以及TLR9活化產(chǎn)生的IFN-beta和TNF-alpha。
　　

13、 基于巨噬細(xì)胞在抗病毒的過程中也發(fā)揮著重要作用，我們觀察了干擾DNMT1對(duì)于VSV和SeV感染的影響。研究發(fā)現(xiàn)DNMT1的干擾能夠影響VSV和SeV引起的IFN-beta的產(chǎn)生，DNMT1能夠促進(jìn)IFN-beta的產(chǎn)生，這提示我們DNMT1可能參與RIG-Ⅰ的信號(hào)通路，對(duì)于其具體機(jī)制，有待于進(jìn)一步的研究和探索。
　　 第三部分CLM-3調(diào)控TLR9觸發(fā)的巨噬細(xì)胞天然免疫功能及其機(jī)制研究
　　 CLM-3(CMRF-35

14、like molecule3)作為CLM家族成員之一，與CLM-5關(guān)系密切，同屬于活化性受體。研究表明CLM-5能夠通過與含有免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine based-activating motif,ITAM)的FcRγ相互作用，進(jìn)而轉(zhuǎn)導(dǎo)活化信號(hào)。CLM-3同樣也能夠與FcRγ相互作用，但是其在天然免疫應(yīng)答中的功能還未得到確認(rèn)。
　　 本實(shí)驗(yàn)室早期的研究發(fā)現(xiàn)CLM-3選擇性地表達(dá)于巨噬

15、細(xì)胞中，CLM-3能夠通過與MyD88結(jié)合以激活MAPK、NFkB通路從而促進(jìn)了TLR9觸發(fā)的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子TNFa和IL-6，研究提示，CLM-3與帶有ITAM基序的FcRγ相互作用，但是，CLM-3調(diào)控TLR9信號(hào)通路的具體分子機(jī)制尚不清楚。
　　 通過研究證實(shí)，CLM-3選擇性地表達(dá)于巨噬細(xì)胞中，為內(nèi)體/溶酶體定位的免疫受體;在TLR9配體CpG-ODN刺激下，CLM-3在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)被下調(diào);CLM-3作為一

16、個(gè)能夠在巨噬細(xì)胞中正向調(diào)控TLR9信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體，主要通過增強(qiáng)TRAF6(TNFR-associated factor6)的泛素化，進(jìn)而促進(jìn)下游MAPKs和NF-κB的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終使得TLR9引發(fā)的天然免疫應(yīng)答反應(yīng)全面活化。研究主要發(fā)現(xiàn)通過與CLM-3的交互作用能夠促進(jìn)TLR9引發(fā)的天然免疫反應(yīng)，最終有利于宿主清除外來入侵病原體。
　　 我們通過激光共聚焦檢測發(fā)現(xiàn)在Raw264.7細(xì)胞系中CLM-3能夠與LAMP1陽性的細(xì)胞器

17、和早期內(nèi)體標(biāo)記Rab5共定位，而對(duì)于高爾基體的代表性標(biāo)記GM130則沒有明顯共定位。因此，CLM-3不像其他細(xì)胞膜定位的CLM家族成員，而是選擇性的定位于膜類細(xì)胞器內(nèi)體及溶酶體。從CLM-3在巨噬細(xì)胞中定位內(nèi)體及溶酶體，我們推測CLM-3可能在TLR9觸發(fā)的巨噬細(xì)胞活化過程中發(fā)揮作用。我們用CpG-ODN刺激siRNA干擾過的原代腹腔巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)CLM-3被干擾后降低TLR9活化引起的TNF-α和IL-6表達(dá)，但是不影響Poly(I∶

18、C)或LPS引起的TNF-α和IL-6的表達(dá)。因此，我們證實(shí)CLM-3能夠選擇性地促進(jìn)TLR9，而非TLR3或TLR4，引起的促炎因子的產(chǎn)生。
　　 為驗(yàn)證CLM-3過表達(dá)在體內(nèi)的作用，我們制備了CLM-3轉(zhuǎn)基因小鼠(CLM-3transgenic mice，CLM-3 TG mice)觀察CLM-3在TLR9觸發(fā)的天然免疫應(yīng)答。Westernblot證實(shí)在原代腹腔巨噬細(xì)胞中高表達(dá)帶HA標(biāo)簽的CLM-3。取自CLM-3 TG m

19、ice的巨噬細(xì)胞相較于同窩未表達(dá)HA-CLM-3的小鼠的巨噬細(xì)胞，在CpG-ODN刺激后能夠產(chǎn)生更多的TNF-α和IL-6，實(shí)驗(yàn)結(jié)果和在巨噬細(xì)胞中過表達(dá)CLM-3的效應(yīng)相一致。在小鼠腹腔注射CpG-ODN后，觀察血清中TNF-α和IL-6的表達(dá)水平也得出相似的結(jié)論，CLM-3 TG mice較同窩對(duì)照小鼠產(chǎn)生更多的炎癥因子。鑒于在漿樣樹突狀細(xì)胞(plasmacytoid dendritic cell，pDC)中TLR9在Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生

20、過程中發(fā)揮著重要作用，我們觀察了從轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟來源的pDC在GpG-ODN刺激后誘導(dǎo)產(chǎn)生Ⅰ型干擾素中的效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)CLM-3轉(zhuǎn)基因小鼠和同窩對(duì)照小鼠來源的pDC在干擾素的產(chǎn)生上并無顯著性差異。研究證實(shí)CLM-3作為一個(gè)能夠正向調(diào)控TLR9觸發(fā)的天然免疫應(yīng)答主要在巨噬細(xì)胞中發(fā)揮作用。
　　 已有研究報(bào)道證實(shí)，MAPKs和NF-κB是CpG-OND觸發(fā)細(xì)胞因子產(chǎn)生的關(guān)鍵信號(hào)通路。在CLM-3轉(zhuǎn)基因小鼠來源的巨噬細(xì)胞中，我們觀察到

21、CLM-3的過表達(dá)能夠促進(jìn)ERK1/2，JNK1/2，以及p38的磷酸化水平，相同的作用趨勢發(fā)現(xiàn)在CLM-3過表達(dá)的Raw264.7細(xì)胞系中。在體外檢測CLM-3轉(zhuǎn)基因小鼠來源的腹腔巨噬細(xì)胞發(fā)現(xiàn)CpG-ODN刺激活化IKKα/β和IκBα的磷酸化水平明顯強(qiáng)于同窩對(duì)照小鼠。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，CLM-3能夠促進(jìn)CpG-ODN觸發(fā)的TLR9信號(hào)通路活化。
　　 通過前面的實(shí)驗(yàn)我們已經(jīng)證實(shí)了CLM-3對(duì)于TLR9的正向調(diào)控作用，對(duì)于潛在

22、的機(jī)制研究將使我們對(duì)于CLM-3的了解更為透徹。報(bào)道證實(shí)，CpG-ODN在結(jié)合到TLR9后，下游信號(hào)分子MyD88能夠招募IRAK1(IL-1 receptor associated kinase1)、IRAK2以及IRAK4。這些IRAK激酶的活化能夠招募TRAF6進(jìn)行泛素化，進(jìn)而激活下游的MPAKs和NF-κB信號(hào)。TRAF6作為TLR9信號(hào)中起關(guān)鍵作用的分子，其泛素化是激活下游信號(hào)活化所必需的。因此，我們想證實(shí)一下CLM-3的過表

23、達(dá)是否會(huì)增強(qiáng)TRAF6的泛素化。在原代腹腔巨噬細(xì)胞中用siRNA干擾CLM-3后，我們檢測了CpG-ODN刺激后TRAF6的泛素化水平，發(fā)現(xiàn)CLM-3的沉默能夠降低TRAF6的泛素化水平。同理，我們檢測了來自于CLM-3轉(zhuǎn)基因小鼠的原代腹腔巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)CpG-OND刺激后，來自CLM-3轉(zhuǎn)基因小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞中的TRAF6的泛素化水平高于同窩對(duì)照小鼠來源的。
　　 在前面的研究中，我們證實(shí)了CLM-3定位于內(nèi)體/溶酶體。所以

24、我們接著探索CLM-3是否能夠直接和TLR9、MyD88或TRAF6相互作用。在進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)來自于CLM-3轉(zhuǎn)基因小鼠的原代腹腔巨噬細(xì)胞中的CLM-3能夠和TLR9發(fā)生微弱的相互結(jié)合，但是和MyD88或TRAF6則沒有相互結(jié)合。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，在CpG-ODN刺激后CLM-3和TLR9之間的結(jié)合增強(qiáng)。這些結(jié)果提示我們在CpG-ODN刺激的作用下，CLM-3能夠和TLR9的結(jié)合增強(qiáng)，進(jìn)而通過促進(jìn)TRAF6的泛素化來增強(qiáng)

25、TRAF6的活性，最終強(qiáng)化了下游的信號(hào)通路，使更多的炎癥因子得到表達(dá)。
　　 通過以上三部分的研究，增進(jìn)了我們對(duì)于天然免疫應(yīng)答過程的了解，通過研究我們發(fā)現(xiàn)在人外周血單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞中DNMT1能夠與eIF3A、eIF3H以及CARP1相互結(jié)合，至于其潛在的作用還有待于進(jìn)一步的研究。在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中觀察到的DNMT1能夠促進(jìn)VSV和SeV引起的IFN-beta產(chǎn)生，使得我們明白DNMT1除了發(fā)揮其經(jīng)典的DNA甲基化轉(zhuǎn)移

26、酶作用外，還有可能參與了天然免疫應(yīng)答。通過研究CLM-3在小鼠巨噬細(xì)胞中對(duì)于Toll樣受體的功能，發(fā)現(xiàn)了CLM-3通過促進(jìn)TRAF6的泛素化增強(qiáng)巨噬細(xì)胞中CpG-ODN引起的TLR9免疫應(yīng)答及機(jī)制，以及CLM-3能夠在CpG-ODN的巨噬細(xì)胞中和TLR9的結(jié)合增強(qiáng)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)CLM-3能夠增強(qiáng)MAPKs的磷酸化以及NF-κB的活化。上述研究拓寬了我們對(duì)于DNMT1和CLM-3分子的性質(zhì)與功能的認(rèn)識(shí)，豐富了TLR免疫識(shí)別及其調(diào)控機(jī)制的研究內(nèi)