SOCS3在靜脈移植物再狹窄中的作用及機制研究.pdf

1、第一部分大鼠SOCS3基因重組腺病毒載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染血管平滑肌細胞后的表達
　　目的：構(gòu)建攜帶大鼠SOCS3基因的重組腺病毒載體并轉(zhuǎn)染大鼠血管平滑肌細胞,評價其轉(zhuǎn)染效果,為靜脈移植物再狹窄轉(zhuǎn)基因治療的實驗研究奠定基礎。
　　方法：用BamHI和EcoRI將目的基因pUC57-Simple-rSOCS3及腺病毒穿梭載體pYr-adshuttle-4(帶GFP標記)行雙酶切;回收酶切質(zhì)粒的目的片段進行連接,產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受

2、態(tài);提取質(zhì)粒酶切鑒定正確后測序。通過LR體外同源重組將rSOCS3表達框構(gòu)建至pAd/PL-DEST腺病毒表達載體上,將腺病毒線性化后轉(zhuǎn)染HEK293細胞包裝腺病毒,PCR鑒定此腺病毒中是否含有rSOCS3基因。放大培養(yǎng)并收集病毒,法測定病毒滴度,將此病毒感染大鼠血管平滑肌細胞,熒光顯微鏡觀察感染效率,realtime-PCR及免疫印跡檢測SOCS3mRNA及蛋白表達。
　　結(jié)果：rSOCS3腺病毒穿梭質(zhì)粒酶切鑒定正確,測序與rS

3、OCS3基因庫中的序列完全相符,PCR鑒定pAd/PL-DEST腺病毒表達載體成功攜帶目的基因rSOCS3,TCID50法測定的最終滴度為2×1010pfu/mL。熒光顯微鏡觀察此病毒感染血管平滑肌細胞的效率在80％以上,realtime-PCR及免疫印跡結(jié)果顯示血管平滑肌細胞中SOCS3mRNA及蛋白表達明顯上調(diào)。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建攜帶大鼠SOCS3基因的腺病毒載體pYrAd-rSOCS3(同時構(gòu)建空質(zhì)粒對照病毒pYrAd-G

4、FP),并在血管平滑肌細胞中高表達,為靜脈移植物再狹窄轉(zhuǎn)基因治療的實驗研究奠定了基礎,具有一定的應用價值。
　　第二部分SOCS3對大鼠移植靜脈內(nèi)膜增生的作用及機制
　　目的：探討大鼠靜脈移植模型中SOCS3對靜脈移植物內(nèi)膜增生的作用及機制。
　　方法：建立大鼠頸外靜脈頸總動脈移植模型,90只大鼠隨機分為三組:對照組;pYrAd-GFP轉(zhuǎn)染組;pYrAd-rSOCS3轉(zhuǎn)染組。每組30只,分別于術(shù)后1天、3天、1周、2周

5、和4周獲取移植靜脈,每個時間點6只,同時取正常靜脈作為空白對照。1天、3天、1周獲取的靜脈用于realtime-PCR及Westernblotting檢測SOCS3、STAT3(僅檢測蛋白)、P-STAT3(Ser727,僅檢測蛋白)、IL-1β、IL-6、MCP-1、ICAM-1、TNF-αmRNA和蛋白表達;2周和4周獲取的靜脈行組織切片,HE染色、EVG染色測量內(nèi)膜厚度,CD68染色巨噬細胞計數(shù),PCNA免疫組化計算血管平滑肌細胞

6、PCNA陽性細胞數(shù)與細胞總數(shù)的比例。
　　結(jié)果：⑴與正常靜脈相比,移植靜脈中的IL-1β、IL-6、MCP-1、ICAM-1、TNF-α、STAT3、P-STAT3及SOCS3mRNA和蛋白表達水平在術(shù)后1周內(nèi)明顯升高;⑵與對照組和pYrAd-GFP轉(zhuǎn)染組比較,pYrAd-rSOCS3轉(zhuǎn)染組術(shù)后SOCS3表達進一步上調(diào)(3天達到峰值),而STAT3、P-STAT3、IL-1β、IL-6、MCP-1、ICAM-1及TNF-α表達則明

7、顯下降,均在一周內(nèi)下降至接近基線水平;(3)與對照組和pYrAd-GFP轉(zhuǎn)染組比較,pYrAd-rSOCS3轉(zhuǎn)染組術(shù)后2周和4周的移植靜脈內(nèi)膜增生明顯減輕;⑷與對照組和pYrAd-GFP轉(zhuǎn)染組比較,pYrAd-rSOCS3轉(zhuǎn)染組術(shù)后2周和4周的移植靜脈PCNA陽性百分比明顯降低;⑸與對照組和pYrAd-GFP轉(zhuǎn)染組比較,pYrAd-rSOCS3轉(zhuǎn)染組術(shù)后2周和4周的移植靜脈內(nèi)膜巨噬細胞總數(shù)顯減少。
　　結(jié)論：靜脈移植到動脈后出現(xiàn)急

8、性炎癥反應,促炎細胞因子水平上升并激活JAK2/STAT3信號通路;作為這一信號通路的生理性負反饋抑制劑SOCS3的表達也同時上調(diào)。然而,誘導移植靜脈過表達SOCS3可抑制JAK2/STAT3信號通路激活,下調(diào)炎癥細胞因子的表達水平,減輕炎癥反應,抑制血管平滑肌細胞增殖和內(nèi)膜增生,說明SOCS3在靜脈移植物再狹窄病程中通過抑制JAK2/STAT3信號通路而發(fā)揮負向調(diào)節(jié)作用。
　　第三部分SOCS3對血管平滑肌細胞炎癥細胞因子表達及

9、遷移增殖的作用及機制
　　目的：探討SOCS3對血管平滑肌細胞炎癥細胞因子表達及遷移增殖的作用及機制。
　　方法：構(gòu)建大鼠SOCS3基因沉默干擾質(zhì)粒SiRNA-rSOCS3和對照質(zhì)粒SiRNA-control。培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細胞。試驗分兩大組:A(上調(diào)組):對照組;PDGF-BB刺激組;PDGF-BB刺激+pYrAd-GFP轉(zhuǎn)染組;PDGF-BB刺激+pYrAd-rSOCS3轉(zhuǎn)染組;B(下調(diào)組):對照組;PDGF-BB組

10、;PDGF-BB刺激+SiRNA-control轉(zhuǎn)染組;PDGF-BB刺激+SiRNA-rSOCS3轉(zhuǎn)染組。用SOCS3基因重組腺病毒載體(pYrAd-rSOCS3)和SOCS3基因沉默干擾質(zhì)粒SiRNA-rSOCS3轉(zhuǎn)染PDGF-BB刺激的大鼠動脈血管平滑肌細胞。Realtime-PCR及WesternBlotting檢測SOCS3、STAT3(僅檢測蛋白)、P-STAT3(僅檢測蛋白)、IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1及

11、ICAM-1的mRNA和蛋白表達,MTT和BrdU檢測血管平滑肌細胞增殖,Transwell檢測血管平滑肌細胞遷移,流式細胞術(shù)檢測檢測細胞周期變化。
　　結(jié)果：⑴血管平滑肌細胞經(jīng)PDGF-BB刺激后,與對照組比較,SOCS3、STAT3、P-STAT3、IL-1β、IL-6、MCP-1、ICAM-1及TNF-α基因和蛋白表達明顯上調(diào);⑵用pYrAd-rSOCS3轉(zhuǎn)染血管平滑肌細胞后再用PDGF-BB刺激,與單獨PDGF-BB刺激組

12、和PDGF-BB刺激+pYrAd-GFP轉(zhuǎn)染組比較,SOCS3表達進一步上調(diào),但STAT3、P-STAT3、IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1及ICAM-1表達明顯下調(diào)。用SiRNA-rSOCS3轉(zhuǎn)染血管平滑肌細胞后再用PDGF-BB刺激,與單獨PDGF-BB刺激組和PDGF-BB刺激+SiRNA-control轉(zhuǎn)染組比較,SOCS3表達明顯下調(diào),而STAT3、P-STAT3、IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1及IC

13、AM-1表達上調(diào);⑶與對照組比較,PDF-BB組中OD值、BrdU陽性細胞數(shù)、遷移至下層的細胞數(shù)及G2/M+S期細胞數(shù)比例明顯增加,G0/G1期細胞數(shù)比例顯著下降。⑷與PDGF-BB和PDGF-BB+pYrAd-GFP組比較,PDGF-BB+pYrAd-rSOCS3組OD值、BrdU陽性細胞數(shù)、遷移至下層的細胞數(shù)及G2/M+S期細胞數(shù)比例明顯下降,G0/G1期細胞數(shù)比例顯著增加;⑸與PDGF-BB和PDGF-BB+SiRNA-contr

14、ol組比較,PDGF-BB+SiRNA-rSOCS3組OD值、BrdU陽性細胞數(shù)、遷移至下層的細胞數(shù)及G2/M+S期細胞數(shù)比例明顯增加,G0/G1期細胞數(shù)比例顯著下降。
　　結(jié)論：PDGF-BB作為血管平滑肌細胞的強刺激因子,可促進其由收縮靜止表型向合成分泌表型轉(zhuǎn)換。激活JAK2/STAT3信號通路,上調(diào)血管平滑肌細胞SOCS3表達通過負反饋調(diào)節(jié)JAK/STAT3信號通路,抑制STAT3的激活及磷酸化而下調(diào)炎性細胞因子表達,抑制血