LRIG1對人膠質(zhì)瘤的抑制作用及其分子機制的研究.pdf

1、第一部分LRIG1在膠質(zhì)瘤中的表達及意義 目的：研究LRIG1及EGFR在不同級別星形細胞腫瘤中的表達及其意義，探討LRIG1在星形細胞瘤中的表達情況及其與腫瘤惡性程度的關(guān)系。 方法：分別應(yīng)用半定量RT-PCR的方法檢測LRIG1和EGFRmRNA在35例星形細胞瘤及4例正常腦組織中的表達水平，免疫組化方法檢測56例星形細胞瘤標本及4例正常腦組織中LRIG1和EGFR蛋白的表達情況，統(tǒng)計分析其在低級別(WHOⅠ～Ⅱ級)和

2、高級別(WHOⅢ～Ⅳ級)星形細胞腫瘤中的表達差異性。 結(jié)果：在35例星形細胞腫瘤中，32例有EGFRmRNA表達，EGFR在低級別(WHOⅠ～Ⅱ級)與高級別(WHOⅢ～Ⅳ級)星形細胞瘤中的轉(zhuǎn)錄表達有顯著性差異(P=0.018)。WHO分級與EGFRmRNA表達呈正相關(guān)(r=0.482，P=0.002)。25例有LRIG1mRNA表達；在低級別(WHOⅠ～Ⅱ級)與高級別(WHOⅢ～Ⅳ級)星形細胞瘤中的轉(zhuǎn)錄表達無顯著性差異。在星形細

3、胞瘤中，LRIG1和EGFRmRNA表達無明顯相關(guān)性(r=0.159，P=0.362)。免疫組化檢測結(jié)果表明，EGFR在腫瘤中陽性率68％，與正常腦組織相比，差異有顯著性(P=0.023)；低度惡度膠質(zhì)瘤(WHOⅠ～Ⅱ級)EGFR陽性表達率55％(16/29)，而高度惡度膠質(zhì)瘤(WHOⅢ～Ⅳ級)EGFR陽性表達率為81％(22/27)，差異顯著(P=0.035)；WHO分級與EGFR蛋白表達呈正相關(guān)(r=0.5597，P＜0.001)。

4、LRIG1在腫瘤中的陽性率低度惡度膠質(zhì)瘤LRIG1(WHOⅠ～Ⅱ級)陽性表達率為24％(7/27)，高度惡度膠質(zhì)瘤(WHOⅢ～Ⅳ級)LRIG1陽性表達率29％(8/29)，兩組之間差異無顯著性(P=0.871)與正常腦組織相比，差異有顯著性(P=0.011)。 結(jié)論：LRIG1的表達強度同EGFR的表達強度及腫瘤的惡性程度沒有明確的關(guān)系；LRIG1的低表達和缺失在不同級別星形細胞瘤中普遍存在，LRIG1的異?？赡茉谛切渭毎鲂纬?/p>

5、的早期就已出現(xiàn)，可能參與星形細胞瘤的發(fā)生發(fā)展。 第二部分EGF對H4神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞LRIG1與EGFR表達的影響 目的：本研究通過EGF體外干預的方法探討在膠質(zhì)瘤中LRIG1的作用環(huán)境和可能存在的和EGFR間的相互影響，證實LRIG1對EGFR的抑制作用。 方法：采用RT-PCR和Westernblot法對不同劑量點(0.1、1、10、100ng/ml)和時間點(24、48、96h)EGF作用的H4神經(jīng)

6、膠質(zhì)瘤細胞LRIG1和EGFRmRNA及其蛋白表達進行定量分析。 結(jié)果：LRIG1和EGFR的表達均有時間和劑量依賴性，但是并不同步。兩者間的變化有相關(guān)性。 結(jié)論：1、EGF可誘導LRIG1的表達，LRIG1可能對EGFR有抑制作用；2、LRIG1的上調(diào)同大劑量EGF和/高表達的EGFR蛋白有關(guān)；3、小劑量的EGF作用下和/或EGFR蛋白上調(diào)緩慢的情況下并無LRIG1的明顯上調(diào)。 第三部分LRIG1基因逆

7、轉(zhuǎn)人膠質(zhì)瘤侵襲性的機制 目的：探討LRIG1基因抑制惡性膠質(zhì)瘤細胞侵襲、浸潤的分子機制。 方法：應(yīng)用脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將pcDNA3.1-LRIG1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人神經(jīng)膠質(zhì)瘤H4和U251細胞系，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡檢測LRIG1和EGFR的表達，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Westernblot方法檢測轉(zhuǎn)染前、后H4細胞LRIG1和EGFR基因mRNA和蛋白表達水平。用Boyden小室體外侵襲試驗觀察H4

8、和U251細胞通過人工重組基底膜能力的變化。 結(jié)果：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-LRIG1質(zhì)粒后，H4和U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞、膠質(zhì)瘤細胞的LRIG1mRNA和蛋白表達均較對照組明顯增強(P＜0.01)；而EGFRmRNA和蛋白表達均較對照組明顯減弱(P＜0.01)。LRIG1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的H4細胞穿過人工重組基底膜的相對百分率分別為13.3±1.8％、11.2±0.9％，明顯低于未處理組和轉(zhuǎn)染空載體組的穿膜細胞百分率24.7±1.8％、

9、24.0±1.5％(P=0.008和P=0.010)，28.9±1.6％、27.5±1.2％(P＜0.001)。 結(jié)論：EGFR的過表達促進了膠質(zhì)瘤的侵襲、浸潤；LRIG1通過抑制EGFR逆轉(zhuǎn)了惡性膠質(zhì)瘤侵襲、浸潤。 第四部分LRIG1誘導人膠質(zhì)瘤細胞凋亡及其分子機制 目的：通過研究LRIG1誘導神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的凋亡作用來探討LRIG1對EGFR信號轉(zhuǎn)導通路抑制效應(yīng)的分子機制。 方法：采用Lip

10、ofectamine介導的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將質(zhì)粒pcDNA3.1-LRIG1轉(zhuǎn)染H4和U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞和原代膠質(zhì)瘤細胞，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Westernblot方法檢測轉(zhuǎn)染后H4細胞LRIG1和EGFR的mRNA與蛋白水平的變化，Westernblot方法檢測H4細胞PKCα、Bax、bcl-2蛋白水平的變化。MTT法和流式細胞技術(shù)分析細胞的增殖和凋亡的變化。 結(jié)果：H4細胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-LR

11、IG1組中LRIG1mRNA的表達水平(1.997±0.114)較未處理組(0.500±0.031)和轉(zhuǎn)染空載體組(0.357±0.035)明顯升高，差異有顯著性(P＜0.0001)；LRIG1的蛋白表達(1.790±0.119)較未處理組(0.717±0.038)和轉(zhuǎn)染空載體組(0.930±0.076)明顯升高，差異有顯著性(P＜0.0001和P=0.001)；而EGFRmRNA的表達水平(0.463±0.033)較對照組(1.157

12、±0.067)和轉(zhuǎn)染空載體組(0.933±0.058)明顯降低，差異有顯著性(P＜0.0001和P=0.002)；EGFR的蛋白表達(0.703±0.067)較對照組(1.280±0.078)和轉(zhuǎn)染空載體組(1.163±0.068)明顯降低，差異有顯著性(P=0.003和P=0.009)。PKCα、Bax表達上調(diào)，bcl-2表達下降，膠質(zhì)瘤細胞生長受到抑制，凋亡顯著增強(P＜0.0001)。 結(jié)論：LRIG1通過參與形成EGFR