NSCs三維培養(yǎng)及其微流控動(dòng)態(tài)模型的構(gòu)建.pdf

1、神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells，NSCs)是一類能夠自我更新，并具有多向分化潛能的細(xì)胞。它的發(fā)現(xiàn)為深入研究神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、神經(jīng)退行性疾病治療以及受損神經(jīng)組織的臨床移植帶來新的希望。而要實(shí)現(xiàn)NSCs的各種潛能則必須對(duì)其各種生理生化特性有正確的認(rèn)識(shí)與了解。因此，體外構(gòu)建與體內(nèi)微環(huán)境相似的NSCs模型是深入研究NSCs各種生理機(jī)制的重要方法與手段，已成為神經(jīng)科學(xué)與神經(jīng)組織工程研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。
　　傳統(tǒng)的NSCs體外細(xì)胞模

2、型主要采用的是二維單層貼壁培養(yǎng)法和“神經(jīng)球”懸浮培養(yǎng)法，細(xì)胞無法真正體現(xiàn)其在體內(nèi)的生物學(xué)特性與功能。而以生物支架為基礎(chǔ)的細(xì)胞三維培養(yǎng)則被認(rèn)為更加接近哺乳動(dòng)物體內(nèi)真實(shí)微環(huán)境，已經(jīng)成為體外研究NSCs增殖與分化機(jī)制、藥物及環(huán)境毒素篩選與評(píng)價(jià)以及構(gòu)建神經(jīng)組織替代物的首選模型。目前，體外構(gòu)建NSCs三維類神經(jīng)組織的研究，在國內(nèi)外還處于實(shí)驗(yàn)探索階段，沒有標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)方法。因此，本文主要在NSCs體外三維培養(yǎng)方式及其生長與分化調(diào)控方面，開展了以下工

3、作:
　　(1)獲取原代小鼠NSCs(mNSCs)并對(duì)其加以鑒定。通過原代培養(yǎng)方法從孕齡14 d的昆明種小鼠胎腦的海馬組織中獲得mNSCs，考察了5個(gè)不同的接種密度對(duì)mNSCs生長趨勢(shì)、所形成的“神經(jīng)球”大小的分布以及擴(kuò)增倍數(shù)的影響。最終確定了原代mNSCs的最佳接種密度為1×105 cells/mL。傳代培養(yǎng)的mNSCs能夠穩(wěn)定表達(dá)NSCs特征蛋白(Nestin和Sox2)，經(jīng)10％胎牛血清誘導(dǎo)能夠分化成神經(jīng)元(β-tubuli

4、n-Ⅲ陽性)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP陽性)以及少突膠質(zhì)細(xì)胞(O1陽性)，表明本實(shí)驗(yàn)分離獲得的mNSCs具有自我更新與多向分化潛能。
　　(2)篩選并確定一種促進(jìn)mNSCs體外擴(kuò)增的無血清培養(yǎng)基MA。三維模型需要足夠的細(xì)胞數(shù)量，因此本研究采用正交試驗(yàn)篩選并確定了能夠提高mNSCs擴(kuò)增倍數(shù)的培養(yǎng)基添加組分及其濃度與比例，MA顯著地促進(jìn)了mNSCs的增殖，細(xì)胞在對(duì)數(shù)增長期的最大密度可達(dá)到(7.25±0.23)×105cells/mL(p

5、＜0.01)，是初始接種密度((1.0±0.1)×105cells/mL)的7.25倍。同時(shí)，免疫熒光染色顯示，MA培養(yǎng)的mNSCs其Nestin的陽性表達(dá)率為94.2±3.5％，說明優(yōu)化后的培養(yǎng)基能很好地維持mNSCs的干細(xì)胞特性。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MA中葡萄糖/谷氨酰胺配比對(duì)mNSCs生長有良好的促進(jìn)作用，進(jìn)一步確定了MA是一種適用于mNSCs體外擴(kuò)增的新型優(yōu)良培養(yǎng)基。
　　(3)提出一種基于兩步培養(yǎng)的體外構(gòu)建mNSCs三維

6、靜態(tài)模型的實(shí)驗(yàn)方法。該方法以0.5mg/mL的(Ⅰ)型膠原水凝膠為支架材料，采用兩步培養(yǎng)法模擬體內(nèi)神經(jīng)發(fā)生的不同階段的生理微環(huán)境。培養(yǎng)初期采用添加了EGF/bFGF/BSA/Lipids的DMEM/F12/RPMI-1640的促mNSCs增殖的培養(yǎng)基MA，待細(xì)胞形成直徑至50-100μm左右的團(tuán)簇時(shí)，將培養(yǎng)基MA更換為含有bFGF和BDNF生長因子的NB/B27條件培養(yǎng)基(MC)。團(tuán)簇中的細(xì)胞開始沿著支架遷移，直到彼此相連形成神經(jīng)組織樣

7、結(jié)構(gòu)。此構(gòu)建物內(nèi)細(xì)胞生長狀態(tài)良好且分布均勻，活率在82％左右，14.17±2.62％細(xì)胞仍保持mNSCs特性，而神經(jīng)元比率為40.93±1.85％，星形膠質(zhì)細(xì)胞比率為27.13±1.63％。
　　(4)建立了一種基于微流控技術(shù)的NSCs三維動(dòng)態(tài)培養(yǎng)方法。mNSCs三維培養(yǎng)技術(shù)與微流控技術(shù)相結(jié)合，設(shè)計(jì)并建立了一套適合mNSCs三維生長的微柱陣列式微流體芯片培養(yǎng)系統(tǒng)。實(shí)現(xiàn)了以膠原水凝膠為支架材料的mNSCs三維復(fù)合物在微流體芯片上的構(gòu)

8、建與生長。結(jié)果顯示，利用靜態(tài)培養(yǎng)條件下建立的兩步法在芯片上構(gòu)建的mNSCs三維復(fù)合物中有NSCs特征蛋白Nestin的表達(dá)，同時(shí)具備分化成神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的能力;對(duì)一個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)的細(xì)胞代謝產(chǎn)物進(jìn)行取樣分析，芯片三維培養(yǎng)體系中乳酸的濃度始終穩(wěn)定在1.0 mmol/mL以內(nèi)，谷氨酰胺濃度維持在2.0 mmol/mL左右，為mNSCs的生長提供一個(gè)穩(wěn)定的生長環(huán)境;而三維靜態(tài)培養(yǎng)條件下乳酸濃度隨著半量換液在2.5～4.5 mmol/mL間波