MiRNAs在大鼠腎移植急性排斥反應中的早期診斷作用.pdf

1、研究背景:自二十世紀初期，就有學者開始嘗試動物腎移植，Ullmann和Decastello在1902年成功地完成了同種動物腎移植。1954年，世界第1例同卵雙生兄弟間的腎移植手術，獲得成功，開啟了腎移植的新紀元，在二十一世紀最初十年，就有從5萬人左右上升到近10萬人在美國器官分享聯合網(UNOS)上注冊等待接受腎移植，且逐年攀升。我國吳階平院士，在1960年最先進行了首例人體腎移植。到1970年末，腎移植作為治療尿毒癥的一種有效手段在大

2、城市逐漸推廣。歷經一個多世紀的發(fā)展，腎移植作為治療終末期腎臟疾病方法，已是首選。正是由于新型免疫抑制劑的大力研發(fā)，加之組織配型技術的成熟，才使得腎移植獲得了舉世矚目的成就。但急性排斥反應(AR)仍是腎移植患者術后經常面臨的最常見風險之一。AR的發(fā)生相當程度上影響了人腎的長期存活率及生活質量，所以， AR的早期診斷和治療就顯得刻不容緩。
　　 臨床上目前診斷AR，主要從臨床特征、血生化指標變化如血肌酐值升高、尿量減少、體重增加、發(fā)

3、熱，伴或不伴蛋白尿、血尿等現象，但往往是出現在移植腎已有病理改變之后，傳統方法尚不能預警診斷AR。在歐美，能及時發(fā)現AR得益于臨床上程序性活檢開展良好，但因其不屬于無創(chuàng)性檢查，且可能出現并發(fā)癥，我國患者普遍不能接受。國內外有研究者利用的血、尿標記物如Perforifractalkine、GB、IP21、FOXP3、PI等診斷AR，但其敏感性、特異性不高。彩色多普勒通過評價移植腎血流灌注來判斷急性排斥反應，但是，慢性排斥反應、免疫抑制劑中

4、毒、移植腎動脈狹窄等術后并發(fā)癥同樣會出現阻力指數(RI)等血流參數的變化。MR擴散加權成像(DWI)檢查由于其可以評價早期移植腎血流灌注，或許能作為監(jiān)測移植腎急性排斥反應的一種無創(chuàng)性檢查，但是腎臟表觀擴散系數(ADC) ADC值波動較大.因此還需深入研究。
　　 MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中發(fā)現的一類內源性的具有調控功能的非編碼RNA，其大小長約18～25個核苷酸，具有高度的保守性、時序性和組織特異性，是調控

5、基因表達的關鍵因子，廣泛參與了機體的各種的調節(jié)途徑，包括發(fā)育、病毒防御、造血過程、器官形成、細胞增殖和凋亡、脂肪代謝等，miRNAs效應分子參與了免疫反應的各個階段，與T、B細胞的分化發(fā)育及B細胞抗體的類別轉換密切相關，具有免疫調控的作用。miRNAs與AR的發(fā)生有著緊密聯系[3-6]。南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院器官移植科2009級碩士研究生課題中提出在小鼠皮膚移植急性排斥反應中miR-142-5p、miR-155存在著過高的表達。Angli

6、cheau et al.[4]研究發(fā)現在腎移植急性排斥反應患者的腎穿組織與正常移植腎比較，miRNA-let-7c,miRNA-10a, miRNA-10b,miRNA-125a, miRNA-200a,miRNA-30a-3p,miRNA-30b,miRNA-30c,miRNA-30e-3p and miRNA-32表達下調，而上調表達的有miRNA-142-5p，miRNA-142-3p，miRNA-155，miRNA-223，mi

7、RNA-146b，miRNA-146a，and miRNa-342。Sui W et al[6]等研究發(fā)現，腎移植術后發(fā)生急性排斥反應的患者， miRNA-324-23p， miRNA-611，miRNA-330,miRNA-524, miRNA-17-3p, miRNA-483, miRNA-663,miRNA-516-5p，miRNA-326，miRNA-197 and miRNA-346表達下調，miRNA-658，miRNA-1

8、25a,miRNA-320,miRNA-381,miRNA-628,miRNA-602,miRNA-629andmiRNA-125a表達上調。Putta et al等在小鼠實驗中發(fā)現miRNA-192通過降低膠原蛋白、TGF-β和纖維連接蛋白的表達進而減慢腎纖維化的進程。Zhou等發(fā)現狼瘡病人合并腎損害尿中miR-27b、miR-192高表達。由此可見，MiRNAs參與了腎移植術后患者排斥反應及移植腎纖維化的疾病演變過程中，所以，通過構

9、建不同大鼠腎移植模型，并檢測血液中miR-192、miR-320和miR-223的變化，來探討其是否對急性排斥反應的發(fā)生起到預警診斷的作用。
　　 根據國內外大鼠腎移植模型文獻報道，選擇Wistar-SD作為供受體研究所需的大鼠腎移植模型，并通過檢測不同大鼠移植模型中miRNAs的變化，來探索尋找無創(chuàng)檢測AR的特異性生物學標記物。
　　 目的:
　　 1.建立大鼠腎移植模型。
　　 2.探討血液中miRN

10、As在大鼠腎移植模型的表達水平變化。
　　 方法: 建立大鼠腎移植模型
　　 1)動物分組實驗分兩組;Wistar大鼠為供者，SD大鼠為受者建立同種異體基因移植組(急性排斥反應組)。Wistar大鼠為供者，SD大鼠為受者術后給予環(huán)孢素A(CsA)免疫抑制(術后第1天起，CsA按2 mg/kg腹腔注射、1次/天)建立同種異體基因移植免疫抑制組(正常腎移植組)，每組10對。
　　 2)腎移植:1％戊巴比妥鈉注射麻醉后

11、，采用原位低溫肝素鈉灌注切取供體左腎，受體于原位在顯微外科操作下腎動脈端端吻合、腎靜脈硬膜外導管支架端端吻合、輸尿管端端吻合大鼠腎移植手術。
　　 3)術后觀察: 預實驗后期，兩組大鼠腎移植術后第1、3、5、7天，取出移植腎，浸入10％中性福爾馬林，切片并進行HE染色進行病理檢查。正式實驗期間，每天觀察攝食、飲水、尿量等一般生存情況及大鼠齒齦、皮毛、活動等個體狀況。尿量＞5mL/d，手術成功，尿量＜1mL/d，需行活檢明確病因。

12、
　　 探討血液中miRNAs在不同大鼠腎移植模型的表達水平變化:
　　 1)動物分組:實驗分兩組;Wistar大鼠為供者，SD大鼠為受者建立同種異體基因移植組(急性排斥反應組)。Wistar大鼠為供者，SD大鼠為受者術后給予環(huán)孢素A(CsA)免疫抑制(術后第1天起，CsA按2 mg/kg腹腔注射、1次/天)建立同種異體基因移植免疫抑制組(正常腎移植組)，每組10對。
　　 2)腎移植:1％戊巴比妥鈉注射麻醉后，

13、采用原位低溫肝素鈉灌注切取供體左腎，受體于原位在顯微外科操作下腎動脈端端吻合、腎靜脈硬膜外導管支架端端吻合、輸尿管端端吻合大鼠腎移植手術。
　　 3)血液中miRNAs的檢測:兩組分別于術前(day0)、術后第一天(day1)、術后第三天(day3)、術后第五天(day5)、第七天(day7)斷尾采血2mL，血液樣本采用EDTA抗凝，-80℃保存。采用miRNA提取試劑盒提取RNA，行逆轉錄反應，然后采用熒光定量PCR法檢測mi

14、r-192、mir-320及mir-223的表達量。根據樣本擴增曲線圖和融解曲線圖，測量熒光信號達到設定的閾值所經過的循環(huán)次數(Ct值)，所得數據采用2-△△Ct法進行分析。
　　 統計學方法:采用SPSS13.0對數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差((x)±s)表示。單因素的組間比較采用單向方差分析，重復測量數據的組間比較采用重復測量數據的方差分析，析因設計資料的組間比較采用析因設計資料的方差分析，多重比較時若滿足方差齊

15、性采用Bonferroni法，若方差不齊采用Dunnett's T3法。以P＜0.05為差異有統計學差異。
　　 結果:
　　 1.兩組大鼠存活狀況及并發(fā)癥預實驗共用50對大鼠，其中Wistar、SD大鼠分別為50只，用于練習制作大鼠腎移植模型，在預實驗期間，受者都常規(guī)在術后3天予以結扎右腎動脈造成右腎缺血壞死，觀察14天，記錄大鼠存活狀況以及各種術后并發(fā)癥發(fā)生情況，(見表1)。練習了顯微技能及模型制作，于3個月后，開始

16、正式實驗，正式實驗大鼠共20對，其中Wistar、SD大鼠分別為20只(非實驗設計死亡的大鼠均依據實驗要求再補充完整)，記錄大鼠存活狀況以及各種術后并發(fā)癥發(fā)生情況，(其中死亡大鼠指非按實驗計劃處死的大鼠)(見表1)。在正式實驗階段，供體手術1～1.5h，受體腎移植血管吻合總時間(30±3)min，輸尿管吻合時間(12±2)，手術時間1.5～2h。
　　 2.兩組大鼠腎組織病理學觀察正常腎移植組腎臟外觀和光鏡下組織觀察基本正常，急

17、性排斥組移植腎外觀蒼白腫脹，光鏡下腎間質呈彌漫性水腫，淋巴細胞和單核細胞多灶狀或彌漫性浸潤，并侵入腎小管管壁出現腎小管炎，部分腎小球內可見單個核細胞和中性粒細胞浸潤。急性排斥組大鼠術后1、3、5、7d組織病理學診斷均有AR。
　　 兩組大鼠不同時間血液中三種miRNA的變化不同組間mir-192的相對表達水平有顯著性差異(F=23.153，P=0.000);不同時間之間的mir-192的相對表達水平亦有顯著性差異(F=24.01

18、9，P=0.000);組別與時間之間的交互效應顯著(F=13.639，P=0.000)。
　　 在術后第五天(day5)，兩組間mir-192的相對表達水平有顯著性差異(F=19.490，P=0.002)，急性排斥組較正常腎移植組顯著升高(P=0.002)。
　　 不同組間mir-320的相對表達水平有顯著性差異(F=16.925，P=0.001);不同時間之間的mir-320的相對表達水平亦有顯著性差異(F=13.33

19、4，P=0.000):組別與時間之間的交互效應不顯著(F=2.978，P=0.128)。
　　 在術后第五天(day5)，兩組間mir-320的相對表達水平有顯著性差異(F=10.172，P=0.020)。
　　 不同組間mir-223的相對表達水平無顯著性差異(F=1.279，P=0.360);不同時間之間的mir-223的相對表達水平有顯著性差異(F=13.987，P=0.000);組別與時間之間的交互效應不顯著(F

20、=0.479，P=0.870)。
　　 結論:
　　 1.Wistar為供者，SD為受者，采用腎動脈端端吻合、靜脈硬膜外導管支架吻合、輸尿管端端吻合能建立穩(wěn)定的腎移植急性排斥反應模型。
　　 2.大鼠血液中mir-192和mir-320在腎移植急性排斥反應早期表達升高，可以用于大鼠急性排斥反應的早期預測。
　　 3.大鼠血液中mir-223在腎移植急性排斥反應早期未有明顯升高，不能用于大鼠急性排斥反應的早