鼠雙微體2(MDM2)在醛固酮誘導的系膜細胞增殖中的作用及機制研究.pdf

1、醛固酮(Aldosterone)是一種類固醇激素,在機體生理及病生理活動中起重要作用。除影響水鹽代謝及循環(huán)容量的經(jīng)典作用,近年的研究表明醛固酮還有許多重要的病生理作用,包括激活氧化應(yīng)激、促進細胞趨化因子的產(chǎn)生及促使組織纖維化等。使用ACEI及血管緊張素受體拮抗劑后產(chǎn)生的“醛固酮逃逸”現(xiàn)象,使得醛固酮在RAS特別是局部RAS激活等一系列致病機制中的作用和地位進一步提高。
　　 醛固酮在人體內(nèi)的作用方式包括基因組調(diào)節(jié)與非基因組調(diào)節(jié)兩

2、種。基因組調(diào)節(jié)是指醛固酮與鹽皮質(zhì)激素受體(MR)結(jié)合形成復合物入核,誘導靶基因轉(zhuǎn)錄翻譯,行使其生物效應(yīng)。非基因方式是指醛固酮與胞漿中的鹽皮質(zhì)激素受體或細胞膜上的受體結(jié)合后通過觸發(fā)一系列第二信使的級聯(lián)反應(yīng)行使其生物效應(yīng)。由于人體內(nèi)糖皮質(zhì)激素、醛固酮與MR的親和力相當,而血漿中糖皮質(zhì)激素的濃度可達醛固酮的100—1000倍,所以能將糖皮質(zhì)激素轉(zhuǎn)化以保證醛固酮與MR作用的高度特異性的11β-羥類固醇脫氫酶(11β—HSD2)的表達是醛固酮基因

3、組調(diào)節(jié)的必要條件。
　　 醛固酮與腎臟病變關(guān)系密切,鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑具有抗蛋白尿、抗腎臟硬化的腎臟保護作用。腎小球系膜細胞增殖是目前較為公認的醛固酮腎臟損害主要表現(xiàn)之一。細胞增殖周期的調(diào)控受促進周期進程的因子(如細胞周期蛋白)及抑制性因子(如p21、p53)共同影響,當促進周期進程的因子增加或抑制性因子減少,系膜細胞即可增殖。有研究表明,醛固酮可通過與鹽皮質(zhì)激素受體結(jié)合,激活一系列磷酸激酶使得S期細胞周期蛋白表達增加并激活相

4、應(yīng)Cdk酶活性,從而使細胞增殖。但醛固酮對于細胞周期抑制性因子如p53是否也存在調(diào)節(jié)作用,目前并無相關(guān)報告。從腫瘤學的研究中得知鼠雙微體2(MDM2)蛋白是一個可與p53形成復合物的核蛋白,該蛋白可以通過介導p53經(jīng)過泛素-蛋白酶體迅速降解而阻止p53介導的調(diào)亡并逆轉(zhuǎn)p53誘導的細胞周期鎖定。有研究指出,在醛固酮介導的血管平滑肌細胞增殖中存在MDM2的表達增加。MDM2是否同樣參與了醛固酮誘導的系膜細胞增殖是本研究將探討的主要問題。

5、r>　　 方法:
　　 以RT—PCR方法檢測人傳代系膜細胞(HMCs)及人系膜細胞株(HMCLs)有無MR、11β—HSD2、MDM2 mRNA的表達。用RT—PCR、Western Blot及流式細胞術(shù)檢測不同濃度、不同作用時間醛固酮對HMCs及HMCLs MDM2表達及S期細胞百分比的影響。將HMCLs分組以醛固酮、針對MDM2設(shè)計的小干擾RNA(siMDM2)、醛固酮+siMDM2刺激,檢測MDM2蛋白表達及S期細胞百

6、分比的改變以明確MDM2在醛固酮誘導系膜細胞增殖中的作用。以螺內(nèi)酯(鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑)抑制試驗檢測鹽皮質(zhì)激素受體是否參與了醛固酮誘導MDM2表達增加。以放線菌酮(蛋白合成抑制劑)抑制試驗檢測醛固酮誘導MDM2表達是否為非基因組機制。為了解體內(nèi)醛固酮水平與系膜細胞MDM2表達關(guān)系,分別選取高醛固酮血癥患者腎活檢組織及正常腎組織,行MDM2及WT1(一種足細胞標記性抗原)免疫組織化學染色,分析兩組間平均單位面積MDM2陽性細胞個數(shù)及平均

7、單位面積WT1陽性細胞個數(shù)的差異。
　　 結(jié)果:
　　 HMCs及HMCLs有MR、11β—HSD2、MDM2的表達,且MDM2蛋白主要表達于細胞核,少量表達于胞漿。醛固酮刺激可使傳代培養(yǎng)的人腎小球系膜細胞MDM2蛋白表達增加,這種增加隨劑量的增加而增加,在醛固酮濃度為10-8mol/L時達峰,為陰性對照的2.725倍,P值小于0.05,具有顯著性差異。醛固酮刺激可使HMCLs的MDM2表達隨時間及劑量增加,在醛固酮濃度

8、為10-。m01.幾、作用時間為24小時達峰,分別為陰性對照的2.27及1.91倍,具有顯著性差異。醛固酮作用5min及1小時不能使MDM2蛋白的表達顯著增加。醛固酮刺激可使HMCLs的S期細胞百分比增加,在醛固酮濃度為10-5M時達峰,為陰性對照的2.77倍,具有顯著性差異。針對MDM2不同DNA片段設(shè)計的siMDM2可使MDM2蛋白表達明顯下降、醛固酮+siMDM2刺激,不能使MDM2蛋白的表達明顯增加,相應(yīng)S期細胞百分比亦不升高。

9、螺內(nèi)酯可抑制醛固酮刺激導致的MDM2 mRNA及蛋白表達增加,與醛固酮刺激組(陽性對照)比,螺內(nèi)酯的抑制率為44.44％。兩者間具顯著性差異,P值小于0.05。蛋白合成抑制劑放線菌酮可抑制醛固酮刺激導致的MDM2表達增加,與醛固酮刺激組(陽性對照)比,兩者間具顯著性差異。在高醛固酮血癥及正常腎臟腎小球切片中,足細胞、系膜細胞MDM2染色均呈陽性。高醛固酮血癥患者的腎小球中平均單位面積MDM2陽性細胞數(shù)目較正常對照者明顯增多,兩組間差異有

10、統(tǒng)計學意義(P=0.004)。而兩者WT1平均單位面積陽性細胞數(shù)目大致相仿(P=0.699)。
　　 結(jié)論:
　　 HMCs及HMCLs有MR、11β—HSD2表達。醛固酮刺激可導致HMCs及HMCLs MDM2表達增加,這種作用在一定范圍內(nèi)呈劑量及時間依賴性。同時醛固酮可使HMCL細胞S期細胞百分比劑量依賴性地提高。針對MDM2不同DNA片段設(shè)計的siMDM2可抑制醛固酮刺激導致的S期細胞百分比增加,進一步提示MDM2