慢病毒載體法高效轉(zhuǎn)基因雞制備技術(shù)研究.pdf

1、轉(zhuǎn)基因雞模型系統(tǒng)在生命科學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，如作為生物反應(yīng)器在雞蛋中表達(dá)功能蛋白、禽類育種及用于胚胎發(fā)育生物學(xué)基礎(chǔ)研究等。本研究的主要目的是探索并建立基于HIV-1慢病毒載體法高效轉(zhuǎn)基因雞制備技術(shù)體系，初步生產(chǎn)表達(dá)人類藥用蛋白——組織纖溶酶原激活劑(tPA)轉(zhuǎn)基因雞，并建立輸卵管特異表達(dá)啟動(dòng)子篩選體系，為今后輸卵管生物反應(yīng)器的開發(fā)應(yīng)用及轉(zhuǎn)基因育種作預(yù)備。 為研究方便，首先以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)為標(biāo)記基因構(gòu)建了基于HI

2、V-1的復(fù)制缺陷型慢病毒載體，并生產(chǎn)病毒(病毒滴度10<'6>個(gè)轉(zhuǎn)染單位/ml)，。病毒感染不同來(lái)源、不同分化特征的細(xì)胞，在所有類型細(xì)胞中均可檢測(cè)到EGFP較高水平的表達(dá)，其中在Hela、293FT細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率約為10<'8>轉(zhuǎn)染單位/ml，C127中為5×10<'7>轉(zhuǎn)染單位/ml，，雞胚胎成纖維(CEF)約10<'6>轉(zhuǎn)染單位/ml，病毒在雞原生殖細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率最低為10<'2>轉(zhuǎn)染單位/ml。病毒的感染可引起細(xì)胞表型的不利改變

3、。用該病毒注射雞囊胚獲得了綠色熒光信號(hào)可直接活體觀察的轉(zhuǎn)基因雞。試驗(yàn)中分兩次共注射204只雞胚，孵化出30只，孵化率15％，其中16只經(jīng)點(diǎn)雜交分析及PCR分析有外源基因的整合，轉(zhuǎn)基因效率53％，在其中兩個(gè)雄性轉(zhuǎn)基因個(gè)體的后代中發(fā)現(xiàn)了外源基因的整合，表明發(fā)生了生殖嵌合現(xiàn)象。在活體中有4只可從體表通過(guò)激發(fā)熒光而直接觀察到綠色熒光信號(hào)。熒光信號(hào)在不同個(gè)體、不同的體表部位表現(xiàn)出不同的表達(dá)特征，多呈點(diǎn)狀分布，主要集中在喙及雞冠兩側(cè)、鼻、耳、爪等皮

4、膚裸露處，前胸、面部等羽毛稀疏處。進(jìn)一步解剖分析表明，外源基因在不同組織中的表達(dá)強(qiáng)度、表達(dá)特性是不一樣的，尤以大、小腸中的表達(dá)最為強(qiáng)烈為彌散型分布，而在肝臟中發(fā)現(xiàn)非均質(zhì)點(diǎn)狀分布。在成年個(gè)體皮膚、肝臟、胰臟、小腸及血管的組織切片中也發(fā)現(xiàn)了強(qiáng)烈的綠色熒光信號(hào)，最為重要的是在睪丸中也發(fā)現(xiàn)了強(qiáng)烈的熒光信號(hào)，綠色熒光集中于睪丸曲細(xì)精管管周。同時(shí)試驗(yàn)中還初步探索了以LM-PCR方法分析外源基因整合位點(diǎn)的可行性。以上結(jié)果表明基于HIV-1的慢病毒載體

5、可以較低的費(fèi)及較低的設(shè)備要求用于高效制備轉(zhuǎn)基因家禽。 在前者研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步構(gòu)建了表達(dá)人類組織型纖溶酶原激活劑的慢病毒載體，在載體中tPA和綠色熒光蛋白以Asp-Pro蟻酸敏感位點(diǎn)結(jié)成融合蛋白。用病毒共注射了34只雞胚，孵化出7只，孵化率20.6％，其中兩只經(jīng)PCR及點(diǎn)雜交方法檢測(cè)有外源基因的整合，兩只個(gè)體均為雄性。由于蛋白融合后可能會(huì)影響GFP蛋白的熒光表達(dá)，在兩只轉(zhuǎn)基因個(gè)體的體表均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)直接可視的綠色熒光信號(hào)，但經(jīng)免疫熒

6、光分析后在其中一只個(gè)體的胰腺中發(fā)現(xiàn)了較弱的目的蛋白的表達(dá)。用F板檢驗(yàn)法，在轉(zhuǎn)基因雞胰臟及肝臟中檢測(cè)到tPA重組蛋白有較高的生物酶活性的。家禽作為生物反應(yīng)器表達(dá)藥用蛋白最為人關(guān)注同時(shí)也最能表現(xiàn)其生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值的地方是實(shí)現(xiàn)在輸卵管中的特異/高效表達(dá)。而實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的關(guān)鍵是篩選合適的啟動(dòng)子。為此克隆了SV40大T抗原(TAG)基因全序列，并構(gòu)建了表達(dá)TAG的neo抗性慢病毒載體，生產(chǎn)病毒后，侵染新開產(chǎn)蛋雞輸卵管上皮原代培養(yǎng)細(xì)胞，篩選建立了永生化

7、輸卵管上皮細(xì)胞，經(jīng)永生化后細(xì)胞的增殖能力有所改善。以此為基礎(chǔ)評(píng)價(jià)不同啟動(dòng)子的表達(dá)效果。共克隆并構(gòu)建了兩種含有不同長(zhǎng)度卵清蛋白(OV)啟動(dòng)子的Blasticidin抗性慢病毒載體，啟動(dòng)子分別為OV1345及OV2964，兩種啟動(dòng)子除后者多了第一內(nèi)含子外其余序列均相同。兩種病毒感染永生化輸卵管上皮細(xì)胞后，經(jīng)篩選穩(wěn)定整合細(xì)胞后，提取DNA及mRNA分別進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明從DNA整合效果上看，含OV1345啟動(dòng)子的病毒是含OV2964啟動(dòng)子