肝豆靈對(duì)銅負(fù)荷大鼠肝組織的miRNA-122和代謝組學(xué)的影響.pdf

1、1、研究背景及目的：
　　Wilson?。╓ilson's disease，WD）又稱(chēng)肝豆?fàn)詈俗冃裕╤epatolenticular degeneration，HLD），是一種常染色體隱性遺傳的銅代謝障礙性疾病。本病患者由于體內(nèi)銅藍(lán)蛋白（Ceruloplasmin，CP）合成障礙以及膽汁銅的排泄障礙，過(guò)量的銅沉積于肝、腦、角膜等臟器組織，引起相應(yīng)臟器功能障礙，臨床以肝損害癥狀、神經(jīng)/精神癥狀、雙眼角膜 Kayser-Fleisch

2、er環(huán)（K-F環(huán)）、腎功能損害為主要表現(xiàn)，嚴(yán)重者可危及生命。研究表明，肝臟是WD最先受累的臟器之一，發(fā)病年齡越小，以肝病為唯一表現(xiàn)的可能性越大。
　　患者由于 ATP7B基因突變導(dǎo)致 ATP7B功能出現(xiàn)缺陷，不能清除體內(nèi)多余的銅，肝臟、大腦、腎等器官和組織(尤其肝臟和腦組織)中出現(xiàn)大量的銅沉積。體內(nèi)過(guò)多的銅誘導(dǎo)自由基反應(yīng)和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，損傷肝細(xì)胞，引起脂肪變性和炎癥，導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡。肝細(xì)胞死亡后將銅釋放入血漿而導(dǎo)致溶血和肝外組織

3、銅沉積，引起受累器官或系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能受損而致病變：如慢性肝炎、肝硬化而導(dǎo)致肝功能衰竭。
　　研究表明，肝細(xì)胞凋亡在所有肝病中均存在，持續(xù)不規(guī)律性肝細(xì)胞凋亡是WD肝損傷的重要原因。最新研究表明，MiRNA調(diào)控著人類(lèi)近三分之一的基因，可以轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控靶基因表達(dá)，細(xì)胞的發(fā)生、分化、增殖、凋亡均受miRNA調(diào)控。MiRNA-122在肝臟中特異性高度表達(dá)。MiRNA通過(guò)靶向調(diào)控凋亡因子直接間接的影響的肝細(xì)胞凋亡進(jìn)程。
　　代謝組學(xué)自

4、誕生以來(lái)在生命科學(xué)多個(gè)領(lǐng)域快速發(fā)展，為研究中醫(yī)藥理論與療效評(píng)價(jià)等關(guān)鍵問(wèn)題提供了研究方法。肝臟是人體代謝的中心器官，參與機(jī)體合成、分解、轉(zhuǎn)化、排泄。代謝組已經(jīng)在病毒性肝炎、肝硬化、肝癌、肝衰竭中進(jìn)行了相關(guān)的研究。但WD中肝臟的代謝組可能與其它肝病的代謝譜不盡相同，因此WD肝臟的代謝組學(xué)研究對(duì)WD的相關(guān)機(jī)制研究尤為重要。
　　前期對(duì)WD患者的研究中發(fā)現(xiàn)，以肝病起病的患者多表現(xiàn)為無(wú)任何臨床癥狀的肝功能異常和肝硬化，甚則以急性肝衰竭起病。

5、導(dǎo)師所領(lǐng)導(dǎo)的課題組在臨床及實(shí)驗(yàn)研究中已經(jīng)證明：中藥復(fù)方肝豆靈可以在促進(jìn)WD患者排銅的同時(shí)保護(hù)肝臟，促進(jìn)肝損傷的恢復(fù)。
　　本實(shí)驗(yàn)主要開(kāi)展以下研究：建立銅負(fù)荷大鼠模型，觀察肝豆靈對(duì)肝組織ALT、AST、TBIL、血清銅、肝銅、肝臟病理的影響，應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡和免疫組化法檢測(cè)了NF-KB、Caspase-3、Bcl-2、Bax的影響，運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)了肝組織中miRNA-122的表達(dá)，進(jìn)一步應(yīng)用代謝組技術(shù)檢測(cè)了肝豆靈

6、對(duì)銅負(fù)荷大鼠肝組織小分子代謝譜的變化，探討肝豆靈治療WD肝損傷的分子機(jī)制。
　　2.方法：
　　2.1實(shí)驗(yàn)分為4組：分別為正常組、模型組、青霉胺組、肝豆靈組；
　　2.2按照文獻(xiàn)復(fù)制銅負(fù)荷大鼠模型；
　　2.3使用肝豆靈對(duì)中藥組大鼠進(jìn)行干預(yù)，選用青霉胺為陽(yáng)性對(duì)照藥；
　　2.4血清ALT、AST、TBIL由全自動(dòng)生化儀測(cè)定，原子吸收法檢測(cè)血銅、肝銅；
　　2.5應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡，免疫組化

7、法檢測(cè)NF-KB、Caspase-3、Bcl-2、Bax的表達(dá)
　　2.6運(yùn)用RT-PRC法檢測(cè)肝組織中miRNA-122的表達(dá)；
　　2.7應(yīng)用UPLC-MS技術(shù)檢測(cè)WD肝損傷大鼠肝組織小分子代謝譜的變化。
　　3.結(jié)果：
　　3.1肝豆靈對(duì)銅負(fù)荷模型大鼠血清銅和肝銅的影響
　　與正常組比較，模型組血清銅、肝銅含量明顯升高（P<0.01），提示銅負(fù)荷大鼠體內(nèi)存在銅蓄積，造模成功；與模型組比較，青霉胺組、肝

8、豆靈組血清銅、肝銅水平顯著降低（P<0.01）；青霉胺血清銅、肝銅水平低于肝豆靈水平（P<0.05）。以上結(jié)果顯示，肝豆靈具有一定的排銅作用，但弱于青霉胺。
　　3.2肝豆靈對(duì)銅負(fù)荷大鼠肝功能的影響
　　各組大鼠肝功能比較：與正常組比較，模型組ALT、AST、TBIL水平顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，青霉胺組和肝豆靈組ALT、AST、TBIL水平顯著降低（P<0.01）；肝豆靈組ALT、AST和TBIL水平顯著低于

9、青霉胺組（P<0.05，或P<0.01）。
　　3.3肝豆靈對(duì)銅負(fù)荷大鼠肝組織病理的影響
　　HE染色結(jié)果顯示，正常組大鼠肝組織中肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞圍繞中央靜脈和匯管區(qū)有序排列，肝細(xì)胞界限明顯，大小基本相同；模型組大鼠肝組織中可見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞界限不清，細(xì)胞核消失、固縮。用藥兩組均較模型組肝損傷程度減輕。
　　3.4肝豆靈對(duì)銅負(fù)荷大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響
　　正常組未見(jiàn)肝細(xì)胞表達(dá)，模型組可見(jiàn)大量凋亡棕褐色

10、肝細(xì)胞表達(dá)，各治療組可見(jiàn)棕黃色梭型肝凋亡細(xì)胞的表達(dá)，模型組較正常組肝凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.01)，各治療組肝細(xì)胞凋亡指數(shù)較模型組明顯降低，肝豆靈組和青霉胺組相比有差異(P<0.05)。
　　3.5肝豆靈對(duì)Caspase-3、Bcl-2、Bax、NF-KB的影響
　　與正常組相比，模型組可見(jiàn)大量棕褐色或棕黃色陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，各治療組可見(jiàn)棕褐色或棕黃色陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，模型組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較正常組表達(dá)明顯升高（P<0.01），各治療

11、組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較模型組顯著降低（P<0.01），肝豆靈組和青霉胺組相比有差異（P<0.05）。
　　3.6各組大鼠肝組織miRNA-122表達(dá)水平比較
　　與正常組比較，模型組miRNA-122表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），與模型組比較，青霉胺組、肝豆靈組miRNA-122表達(dá)水平顯著升高（P<0.05，或P<0.01）；肝豆靈組miRNA-122表達(dá)水平顯著高于青霉胺組（P<0.05）。3.7肝豆靈對(duì)銅負(fù)荷大鼠代謝組學(xué)的

12、影響
　　模型組中溶血磷脂酰膽堿（20：5、18：2、16：0、18：3、20：1、20：3）、油酸酰胺下降，顯著下降，色氨酸、苯丙氨酸、硬脂酰胺、?；撬狴Z脫氧膽酸、甘氨膽酸、?；悄懰犸@著上升。肝豆靈對(duì)提高溶血磷脂酰膽堿（20：5、18：2、16：0、18：3、20：1、20：3）、油酸酰胺的含量，降低色氨酸、苯丙氨酸、硬脂酰胺、牛磺酸鵝脫氧膽酸、甘氨膽酸、?；悄懰岬暮俊?br>　　4.結(jié)論：
　　4.1本研究采用銅負(fù)荷法

13、復(fù)制了銅過(guò)量大鼠模型，模型組可見(jiàn)銅過(guò)量后肝損傷病理改變，該模型可反映銅過(guò)量沉積導(dǎo)致肝損傷的病理。
　　4.2本研究發(fā)現(xiàn)銅過(guò)量負(fù)荷大鼠模型可見(jiàn)ALT、AST、TBIL、血清銅和肝銅明顯升高，各治療組均較模型組下降，肝豆靈組ALT、AST、TBIL下降更明顯，青霉胺組血清銅和肝銅低于肝豆靈組，提示肝豆靈對(duì)銅負(fù)荷大鼠有抑制肝損傷作用，排銅效果弱于青霉胺。
　　4.3本研究發(fā)現(xiàn)銅過(guò)量負(fù)荷大鼠模型組凋亡細(xì)胞大量表達(dá)，各治療組凋亡細(xì)胞較

14、模型組降低，提示肝豆靈對(duì)銅負(fù)荷大鼠有抗肝細(xì)胞凋亡作用。
　　4.4本研究發(fā)現(xiàn)模型組Caspase-3、Bcl-2、Bax、NF-KB陽(yáng)性表達(dá)，各治療組較模型組明顯改善。提示銅負(fù)荷大鼠肝損傷時(shí)Caspase-3、Bcl-2、Bax、NF-KB被激活，參與了WD銅負(fù)荷大鼠肝損傷的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。肝豆靈可能通過(guò)對(duì)Caspase-3、Bcl-2、Bax、NF-KB的抑制作用發(fā)揮了保護(hù)肝臟改善肝損傷作用。
　　4.5本研究發(fā)現(xiàn)模型組m

15、iRNA-122含量明顯降低，各治療組較模型組明顯升高，肝豆靈組升高較模型組明顯。提示銅負(fù)荷大鼠肝損傷時(shí)miRNA-122可能參與了WD銅負(fù)荷大鼠的肝損傷的發(fā)生發(fā)展，肝豆靈可能通過(guò)升高miRNA-122發(fā)揮了保護(hù)肝臟改善肝損傷作用，miRNA-122可作為肝損傷特異性指標(biāo)，miRNA-122可能通過(guò)Caspase-3、Bcl-2、Bax、NF-KB介導(dǎo)了肝細(xì)胞凋亡。
　　4.6采用UPLC-MS的代謝組學(xué)方法研究了肝豆靈對(duì)銅負(fù)荷大