丙烯酰胺母源性暴露對母鼠大腦髓鞘毒性和對仔鼠髓鞘化的影響.pdf

1、丙烯酰胺（Acrylamide，ACR）是一種常見的化工原材料，廣泛應(yīng)用于采礦業(yè)、造紙業(yè)、紡織業(yè)、污水處理、土壤調(diào)節(jié)和科研實驗等多種領(lǐng)域。一般來說聚丙烯酰胺沒有毒性，但動物實驗已證實單體ACR具有神經(jīng)毒性、生殖毒性、遺傳毒性和致癌性等。目前已經(jīng)在人體發(fā)現(xiàn)其神經(jīng)毒性，主要表現(xiàn)為肢體乏力、共濟失調(diào)、感覺過敏等一系列的臨床癥狀。一直以來，關(guān)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究主要集中在大腦皮質(zhì)。近些年來的研究顯示，白質(zhì)的病變與很多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關(guān)

2、。由于白質(zhì)血管分布比較少，白質(zhì)比大腦皮質(zhì)更容易受到損傷。有研究顯示，腦白質(zhì)損傷的患兒腦癱發(fā)生率可增加15倍。
　　孕哺期是女性的特殊生理時期，由于抵抗力下降，對各種有害因子更加敏感?？赡芘c激素水平改變有關(guān)，女性在產(chǎn)后3個月內(nèi)大腦脫髓鞘改變發(fā)生率較高。近年來由于圍產(chǎn)技術(shù)的提高，新生兒的存活率增加，但小兒神經(jīng)系統(tǒng)疾病亦呈增加的趨勢。嬰幼兒處于生長發(fā)育關(guān)鍵時期，由于各器官功能尚未發(fā)育完善，更容易受到各種因素的干擾而增加發(fā)生多種小兒腦病的

3、風險。關(guān)于ACR對孕哺期母嬰腦白質(zhì)或髓鞘的毒性作用，至今在國內(nèi)、外的研究報道較少。關(guān)注ACR對這兩種特殊群體髓鞘的影響，有利于保障母嬰雙方的健康，提高生育質(zhì)量。
　　為此，我們擬建立SD大鼠ACR母源性暴露的模型，通過免疫組織化學(xué)法、western免疫印跡法、堅牢藍染色和透射電鏡等技術(shù)，研究ACR對母鼠髓鞘的神經(jīng)毒性和對仔鼠髓鞘發(fā)育的影響。由于髓鞘是少突膠質(zhì)細胞的突起纏繞在神經(jīng)元軸突所形成，是神經(jīng)元發(fā)育的重要組成部分，本實驗進一步

4、檢測ACR染毒對仔鼠神經(jīng)元和突觸形成與發(fā)育的影響。
　　方法：
　　1.動物模型的建立：SPF級SD大鼠，雌鼠40只，其中備用雌鼠8只，雄鼠16只，均為6周齡鼠，體重180-200g。適應(yīng)性飼養(yǎng)6周后，隨機以1:1的比例雌雄大鼠同籠交配，逐日早晨檢查陰栓，查到陰栓，則確認交配成功，并定當天為妊娠第0天。將孕鼠隨機分為四組，每組8只，于妊娠第15天開始灌胃給藥，實驗組給予ACR劑量分別為4.5mg/kg，9mg/kg，18mg

5、/kg，對照組給予同等劑量的雙蒸水，連續(xù)給藥至仔鼠出生后第14天（出生當天為第0天）。每窩幼鼠在出生后第3天稱重并都隨機保留10只，分別在出生后第7天和第14天各取材5只。
　　2.檢測ACR對母鼠髓鞘的毒性作用：母鼠行為學(xué)檢測；Nissl染色檢測母鼠皮質(zhì)尼氏小體的變化；HE染色檢測母鼠胼胝體結(jié)構(gòu)的變化；LFB染色檢測母鼠胼胝體脂類的表達情況；免疫組織化學(xué)法和western免疫印跡法檢測母鼠胼胝體GFAP、PLP和MBP蛋白的表達

6、。
　　3.檢測ACR對仔鼠髓鞘化的影響：仔鼠行為學(xué)檢測；LFB染色檢測仔鼠白質(zhì)脂類的表達情況；免疫組織化學(xué)法和免疫熒光法檢測P7、P14仔鼠內(nèi)囊和胼胝體髓鞘相關(guān)蛋白PLP、MBP的表達情況；western免疫印跡法定量分析P7、P14仔鼠大腦PLP、MBP蛋白的表達情況；透射電鏡觀察P14仔鼠大腦額葉皮質(zhì)下白質(zhì)髓鞘的結(jié)構(gòu)。
　　4.檢測ACR對仔鼠神經(jīng)元和突觸發(fā)育的影響：通過免疫組織化學(xué)法檢測P14仔鼠海馬區(qū)域DCX、GA

7、P-43、GFAP的表達；western免疫印跡法檢測仔鼠大腦DCX、SYP、GFAP的表達情況；透射電鏡觀察仔鼠額葉皮質(zhì)突觸的結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果：
　　1.ACR對母鼠的影響：ACR染毒結(jié)束后，與對照組和低劑量組母鼠相比較，中、高劑量組母鼠步態(tài)得分明顯增加（P＜0.01）；與對照組相比較，高劑量組母鼠產(chǎn)后體重明顯下降（P＜0.05）；Nissl染色顯示，高劑量組母鼠皮質(zhì)尼氏小體減少、變??；HE染色顯示高劑量組胼胝體較對照組小

8、，內(nèi)部組織疏松改變；ACR各劑量組母鼠LFB染色變淺；免疫組織化學(xué)方法和western免疫印跡法檢測結(jié)果顯示，與對照組相比較，低、中、高劑量組母鼠大腦GFAP的表達顯著增加（P＜0.01）；與對照組相比較，中、高劑量組母鼠大腦髓鞘蛋白PLP和MBP的表達均明顯比對照組少（P＜0.05）。
　　2.ACR對仔鼠大腦髓鞘化的影響：與對照組相比較，高劑量組仔鼠存活率明顯下降（P＜0.05），P0、P7、P14高劑量組仔鼠體重均明顯降低（

9、P＜0.05）；對照組仔鼠LFB染色呈亮藍色，ACR染毒后染色變淺甚至消失；免疫組織化學(xué)檢測和western免疫印跡法結(jié)果顯示，ACR染毒后P0、P7、P14各劑量組仔鼠大腦髓鞘蛋白PLP和MBP表達皆有下降，其中，中、高劑量組與對照組相比表達下降比較明顯（P＜0.05）；透射電鏡下P14高劑量組仔鼠成熟髓鞘數(shù)量減少，髓鞘板層排列紊亂，板層之間出現(xiàn)松解分離，甚至形成囊泡樣改變。
　　3.ACR對P14仔鼠神經(jīng)元和突觸的影響：免疫組

10、織化學(xué)法結(jié)果顯示，P14仔鼠海馬齒狀回DCX、GAP-43、GFAP陽性表達均較對照組明顯減少（P＜0.05）；western免疫印跡法結(jié)果顯示，與對照組相比較，高劑量組仔鼠大腦DCX、SYP、GFAP的陽性表達均顯著下降（P＜0.05）；透射電鏡下，對照組仔鼠大腦額葉皮質(zhì)突觸數(shù)量較多、染色深、細胞結(jié)構(gòu)清晰，高劑量組突觸數(shù)目少、著色淺、細胞結(jié)構(gòu)不清晰。
　　結(jié)論：
　　1.ACR母源性暴露后母鼠和仔鼠均出現(xiàn)了神經(jīng)毒性反應(yīng)；<