α1,2-巖藻糖基轉移酶基因轉染對卵巢癌細胞RMG-I蛋白組學變化的影響.pdf

1、卵巢癌在婦科惡性腫瘤中病死率居首位，五年生存率一直徘徊在20～30％，主要原因是：①難以早期發(fā)現(xiàn)；②術后易復發(fā)；③化療易產生多藥耐藥。卵巢癌的發(fā)生機制一直是婦科腫瘤基礎研究與臨床研究的重點，掌握卵巢腫瘤惡性生物學行為的分子機制對于卵巢癌的預防、診斷及治療十分重要。上述問題的解決都有賴于對其相關信號轉導通路中信號分子的構成及其相互作用關系的闡明。
　　 細胞膜上存在的糖復合物與細胞間的相互黏附、識別、細胞惡變、侵襲及轉移等細胞生物

2、學特性密切相關。細胞癌變后細胞中的糖復合物，特別是細胞膜上糖復合物中的糖鏈部分發(fā)生結構和量的變化，使其作為腫瘤標志物在臨床工作中被廣泛應用。在卵巢癌，主要表現(xiàn)為Ⅱ型糖鏈的變化，如Lewisy及Lewis x等組織-血型抗原的改變。75%的卵巢癌出現(xiàn)Lewisy不同程度的高表達；上皮性卵巢腫瘤標志物CA125的結構中含有Lewisy結構，說明Lewisy與上皮性卵巢腫瘤關系密切。Lewisy是雙巖藻糖基化的寡糖。巖藻糖是終末糖基，其加入后

3、糖鏈的加工終止，糖鏈的結構不再改變。正常情況下，Lewisy抗原主要表達于胚胎發(fā)生時期，在成人其表達則限于粒細胞和上皮組織細胞表面。當上皮組織發(fā)生癌變時，60%～90%的病人出現(xiàn)Lewisy抗原表達明顯增高，如卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、結腸癌和非小細胞肺癌等，且Lewisy的水平與腫瘤的發(fā)展和預后相關。
　　 Lewisy的上述特點使其成為腫瘤化療的候選藥靶。雖然目前針對Lewisy抗原靶點的治療藥物已經進入Ⅱ期臨床試驗，但是L

4、ewisy與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的相關機制研究甚少，了解有哪些蛋白參與其過程非常重要。α1，2-巖藻糖基轉移酶基因(futl)是Lewisy合成的關鍵酶，我們在前期研究工作中，通過將人futl基因穩(wěn)定轉染入卵巢癌細胞系RMG-I中，成功構建了Lewisy高表達細胞模型RMG-I-H。并對其進行了相關系列研究，發(fā)現(xiàn)Lewisy作為眾多受體表面的一部分，其表達增加活化受體進而激活了下游的PI3K/Akt和Raf/MEK/MAPK等信號轉導通路，導

5、致細胞核內HER2/neu等基因轉錄的加速，刺激DNA合成，加快細胞跳過G1期限制點進入S期，從而促進腫瘤細胞增殖、粘附、侵襲、轉移、耐藥等惡性生物學行為增強。信號轉導通路網絡復雜，Lewisy作用機制仍然不十分清楚。本文利用已建立的卵巢癌細胞模型RMG-I-H與其親本細胞系RMG-I進行研究，目的在于探索Lewisy高表達細胞中差異表達蛋白的構成、相互作用關系及其與腫瘤生物學行為的相關性。為進一步研究Lewisy抗原高表達在卵巢癌中的

6、作用機制及相關生物治療提供科研思路和理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 第一部分：將轉染futl基因與轉染空質粒載體的細胞系RMG-I-H與RMG-I-C進行2-DE分析與MALDI-TOF-MS鑒定，從而獲得Lewisy高表達細胞中差異表達蛋白的構成。利用蛋白間相互作用預測軟件STRING，將蛋白質組學結果與相應已完成的基因芯片結果聯(lián)合建模，構建蛋白間的相互作用網絡。通過檢索UniPro蛋白質數(shù)據(jù)庫進一步分析差異表達蛋白的

7、生物學作用與細胞定位。利用文獻檢索軟件PubMatrix建立檢索矩陣，分析Lewisy高表達細胞中的差異表達蛋白與腫瘤惡性生物學行為的相關性。
　　 第二部分：選取蛋白質組學結果中與PI3K信號通路密切相關的肌醇單磷酸酶IMPA1作為研究對象，利用Western blot方法分別檢測三對細胞系RMG-I與RMG-I-H(Lewisy相關)，SKOV3與SKOV3/DDP(順鉑耐藥相關，Lewisy相關)，HP8910與HP891

8、0/PM(轉移相關，Lewisy相關)中IMPA1表達水平；利用Lewisy單克隆抗體對RMG-I-H細胞表面抗原進行阻斷，檢測阻斷后細胞中IMPA1表達量與之是否存在時間依賴性與劑量依賴關系。采用免疫化學方法檢測細胞爬片與臨床病理切片中目的蛋白的定位與表達水平，并分析目的蛋白與各種病理學參數(shù)間的關系。
　　 結果：
　　 第一部分：蛋白質組學方法共鑒定出21個差異表達蛋白，主要分布于胞質與胞核，參與信號轉導，增殖、凋亡

9、及物質代謝等過程。蛋白質相互作用建模發(fā)現(xiàn)了兩個作用核心：PCNA和ERBB2。文獻挖掘發(fā)現(xiàn)蛋白質組學結果中有35%與腫瘤密切相關，主要參與增殖與凋亡；基因組學結果中有50%與腫瘤密切相關，主要參與增殖與粘附。
　　 第二部分：IMPA1在耐藥、轉移、Lewisy高表達細胞中高表達；IMPA1表達對Lewisy單克隆抗體阻斷作用存在明確的時間與劑量相關性，低濃度時下調，中、高濃度則強烈上調；細胞和組織免疫化學結果證明IMPA1在胞

10、漿及胞核內均有表達，以胞漿表達為主。核表達陽性率在年輕病人和粘液性卵巢癌中明顯增高。
　　 結論：
　　 1、文獻挖掘結果提示Lewisy高表達細胞中的差異表達蛋白與腫瘤增殖、耐藥、轉移、粘附、凋亡等生物學行為相關，尤其與增殖和粘附的關系最為密切。
　　 2、PCNA與ERBB2是差異表達蛋白相互作用預測網絡模型的核心蛋白，可能在Lewisy高表達卵巢上皮腫瘤的生物學特性變化機制中發(fā)揮重要作用。
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