重組BPI蛋白對感染綿羊支原體肺炎的盤羊雜交羊的免疫調節(jié)及治療效果研究.pdf

1、目的：本試驗以感染綿羊肺炎支原體(MO)的綿羊為疾病模型，使用重組 BPI蛋白(rBPI)治療感染 MO的盤羊雜交羊，然后用 real-time QPCR與 ELISA的方法，測定 BPI和相關細胞因子的含量，用血常規(guī)方法檢測血液各項生理指標，以研究 rBPI對感染 MO的盤羊雜交羊的免疫調節(jié)效果。
　　方法：（1）綿羊肺炎支原體的人工感染：將凍存的 MO菌種進行復壯培養(yǎng)，測定菌液濃度并稀釋到備用濃度106CCU/mL。然后將6只

2、巴什拜羊為 A組，12只盤羊雜交羊隨機分為 B、C組，全部氣管內注射綿羊肺炎支原體，每天觀察臨床癥狀并測量記錄體溫。兩周后每組隨機取3只試驗羊的鼻腔分泌物，進行 MO的培養(yǎng)與生化鑒定，檢測人工感染情況。（2）rBPI對感染 MO的盤羊雜交羊的治療作用：在試驗的第4 d，C組雜交羊使用純化的 rBPI對其治療，150mg/只/天，而 A組和 B組每天注射生理鹽水，繼續(xù)觀察臨床癥狀并記錄體溫。實驗結束后將所有羊解剖觀察肺臟病理變化，并制作病

3、理切片進行病理評分，對比各組羊的差別。（3）rBPI對感染 MO的盤羊雜交羊的內源 BPI mRNA水平的影響：分別在感染前（0 d）、感染后第二天（2 d）、感染后五天（5 d）、一周（7 d）、兩周（14 d）、三周（21 d），采血分離嗜中性粒細胞，用 real time-QPCR方法檢測試驗羊 BPI mRNA的相對表達水平。（4）rBPI對感染 MO的盤羊雜交羊的免疫調節(jié)作用：分別在第0 d、1 d、5 d、7 d、14 d、

4、21 d，采血分離血清，用 ELISA方法檢測試驗羊 IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α及IFN-γ的含量，比較各組羊細胞因子的表達變化差異。（5）rBPI對感染 MO的盤羊雜交羊的血液部分生理指標測定：分別在第0 d、7 d、14 d，采集各組羊的外周血進行血常規(guī)檢測。
　　結果與結論：（1）鼻腔分泌物用支原體專用培養(yǎng)基培養(yǎng)5d培養(yǎng)液變黃，葡萄糖發(fā)酵試驗顯示培養(yǎng)液由紅變黃呈陽性；水解精氨酸試驗顯示培

5、養(yǎng)液未變色呈陰性；洋地黃皂苷試驗顯示抑制帶>0.3cm為陽性；氯化四氮唑還原實驗顯示瓊脂培養(yǎng)基呈紅色；紅細胞吸附試驗顯示菌落表面布滿紅細胞，溶血試驗為β溶血。說明鼻腔分泌物中含有MO，試驗羊人工感染成功。（2）A組巴什拜羊在感染后2-3 d均表現(xiàn)為食欲減退、體溫一過性升高（40-41℃）、呼吸啰音，無死亡病例，剖檢后肺表面有輕微出血點；B組雜交羊體溫升高（40-41℃）持續(xù)較久，有咳嗽、流漿液性鼻涕，甚至嚴重呼吸啰音及腹瀉癥狀，其中2只

6、死亡，剖檢肺表面有不同程度的粉色肉變和肝變，有出血點和出血斑。C組雜交羊起初體溫升高、食欲減退、咳嗽癥狀，剖檢肺表面有出血點和出血斑。組織病理學評分結果：A組平均分為9.4，B組平均分19.9，C組平均分為12.8，B組評分顯著高于A、C組（P<0.05;P<0.05）。說明雜交羊在治療后臨床癥狀及肺部炎癥減輕。（3）在第7 d，C組BPI基因的相對表達水平顯著低于A、B組（P<0.05），在第14-21d C組極顯著高于B組（P<0.

7、01），而在第7-14 d A組極顯著高于B組（P<0.01）。說明了注射rBPI對體內BPI的表達水平有影響。（4）從感染后的第7-21d，C組的IL-1β含量分別極顯著低于A、B（P<0.01）。在感染后的第7-21 d，C組IL-4含量分別極顯著高于對照組A、B（P<0.01）；在第14-21d，A組IL-4顯著高于B組（P<0.05）。第14-21 d，C組的IL-6極顯著低于A、B組（P<0.01），A組也顯著低于B組（P<0

8、.05）。在感染后第7 d，C組IL-8濃度顯著低于A組（P<0.05）；在第14-21d，B組的極顯著高于A組（P<0.01;P<0.01）。在第5 d，C組IL-10顯著高于A組（P<0.05），極顯著低于B組（P<0.01）；在第14 d，C組極顯著低于A組（P<0.01），顯著高于B組（P<0.05）；在第21 d，C組顯著低于A組（P<0.05），極顯著高于B組（P<0.01）。在第14 d，C組IFN-γ含量顯著高于A組（P

9、<0.05）；在第21 d，C組顯著低于B組（P<0.05），但極顯著高于A組（P<0.01）。在感染第14 d，C組TNF-α顯著低于B組（P<0.05），顯著高于A組（P<0.05）；在第21 d，C組的TNF-α顯著低于B組（P<0.05），但極顯著高于A組（P<0.01）。（5）在感染前，雜交羊WBC、LYM、LYM％、RBC顯著高于巴什拜羊，而MID、MID%、MCHC低于巴什拜羊。注射rBPI后，在第14 d，C組WBC、G