墊狀卷柏化學成分及Selaginellin抗衰老作用與機制研究.pdf

1、第一章概述 概括了國內(nèi)外卷柏屬植物化學成分和藥理活性的研究狀況，明確了本課題的研究目標主要為：利用現(xiàn)代色譜分離技術(shù)和光譜方法，系統(tǒng)研究墊狀卷柏的活性化學成分，重點研究其selaginellin的結(jié)構(gòu)類似成分；在細胞水平上，闡明selaginellin在同型半胱氨酸誘導的血管內(nèi)皮細胞衰老的作用，以期為動脈粥樣硬化等心血管疾病治療尋找一種新型的先導化合物，為創(chuàng)新藥物的研究提供試驗依據(jù)。 第二章墊狀卷柏的化學成分研究

2、研究背景：墊狀卷柏(Selaginella pulvinata Maxim.)為卷柏科卷柏屬植物，2005年版《中華人民共和國藥典》收載了墊狀卷柏S.pulvinata(Hook.et Grev.)Maxim.和卷柏S.tamariscina(Beauv.)Spring兩種植物，卷柏具有活血通經(jīng)之功效。自1971年，Okigawa首次從卷柏(S.tamariscina)中分離出5個黃酮類化合物以來，至今已有34個黃酮類化合物從卷柏屬植物

3、中分離鑒定。其它化學成分為苯丙素類、生物堿類、有機酸類、蒽醌類、甾類等。蘭州大學Li-Ping Zhang等從S.sinensis中分離出新型碳骨架結(jié)構(gòu)的化合物，命名為selaginellin。 藥理研究提示，卷柏屬植物的雙黃酮類化合物具有抗氧化和抗病毒以及對心血管的作用。亦有文獻報道，卷柏屬植物具有抗炎和提高免疫能力等作用。本項研究旨在利用現(xiàn)代色譜分離技術(shù)和光譜方法，系統(tǒng)研究墊狀卷柏的活性化學成分，重點研究其selaginel

4、lin的結(jié)構(gòu)類似成分。 方法：運用柱色譜技術(shù)和制備高效液相色譜方法分離、純化化學成分。UV、IR、1H-NMR、13C-NMR、2D-NMR、MS、HRMS等光譜分析方法，鑒定化合物的結(jié)構(gòu)。 結(jié)果： (1)從墊狀卷柏75％的乙醇提取物中，共分離11個化合物。 (2)經(jīng)UV、IR、1H-NMR、13C-NMR、2D-NMR、MS和HRMS以及各化合物的理化性質(zhì)，分別鑒定為β-谷甾醇(β-sitostol)、

5、墊狀卷柏膽甾酮(pulvinatadione)、穗花衫雙黃酮(amentoflavone)、墊狀卷柏雙黃酮(pulvinatabiflavone)、橡膠樹雙黃酮(heveaflavone)、異柳杉雙黃酮(Isoeryptomerin)、selaginellin、墊狀卷柏三酚(pulvinataphentriol)、墊狀卷柏二醇(pulvinatadiol)、墊狀卷柏醛(pulvinatahyde)、墊狀卷柏二酚(pulvinataphe

6、ndiol)。 (3)墊狀卷柏膽甾酮、墊狀卷柏雙黃酮、墊狀卷柏三酚、墊狀卷柏二醇、墊狀卷柏醛和墊狀卷柏二酚為新化合物。 結(jié)論： 1.從墊狀卷柏中分離得到11個化合物，其中墊狀卷柏膽甾酮(pulvinamdione)、墊狀卷柏雙黃酮(pulvinatabiflavone)、墊狀卷柏三酚(pulvinataphentriol)、墊狀卷柏二醇(pulvinatadiol)、墊狀卷柏醛(pulvinatahyde)和墊狀卷柏二酚

7、(pulvirmtaphendiol)為新化合物。 2.墊狀卷柏三酚、墊狀卷柏二醇、墊狀卷柏醛和墊狀卷柏二酚等四個化合物為全新結(jié)構(gòu)的炔酚類化合物。 第三章 Selaginellin對同型半胱氨酸誘導的血管內(nèi)皮細胞衰老的影響及機制研究 研究背景：動脈粥樣硬化(AS)是嚴重危害人類的健康的主要疾病之一。AS發(fā)病原因及機制十分復雜。同型半胱氨酸(Hcy)為含有巰基的氨基酸，能促進動脈粥樣硬化形成，增加冠心病患者的病死率

8、，被認為是AS的獨立危險因素。 血管內(nèi)皮功能不全是AS血管早期的一個重要病變特征，被認為是AS發(fā)生的始動環(huán)節(jié)。血管內(nèi)皮功能不全與內(nèi)皮細胞的衰老及功能紊亂密切相關(guān)。氧化應激被認為是導致細胞衰老的關(guān)鍵因素。此外，細胞抗衰老基因表達的下調(diào)也是細胞衰老的重要原因?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種抗衰老相關(guān)基因，其中klotho基因在調(diào)控內(nèi)皮細胞衰老中起重要作用。研究顯示，Hcy致AS作用與其誘導內(nèi)皮細胞衰老有關(guān)。 卷柏屬于蕨類卷柏科卷柏屬植物，具有

9、降血壓、降血糖、增強人體免疫功能和抑制氧化應激等作用。Selaginellin為卷柏中提取的一種具有全新結(jié)構(gòu)的單體化合物，體外抗氧化實驗結(jié)果顯示，selaginellin具有較強的抗氧化作用?；谝陨涎芯勘尘?，本實驗擬在培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞觀察selaginellin對Hcy誘導的細胞衰老的影響并探討可能涉及的機制。 方法：培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)。MTS法檢測細胞活力；以β-半乳糖苷酶活性(染色法)和端粒酶活性(TRAP

10、-銀染法)檢測細胞衰老；用活性氧熒光試劑盒檢測細胞內(nèi)ROS的生成；實時定量PCR檢測細胞內(nèi)klotho mRNA的表達。 結(jié)果： (1)觀察10個濃度的selaginellin(3×10-9-10-4 M)對內(nèi)皮細胞活力的影響。MTS結(jié)果顯示，當selaginellin濃度低于10-6M時對內(nèi)皮細胞活力無明顯影響，而高于10-6M時能顯著降低細胞活力。 (2)Hcy(0.5×10-3M)處理內(nèi)皮細胞60 h，能顯

11、著增加β-半乳糖苷酶活性和降低細胞端粒酶活性，提示Hcy能誘導內(nèi)皮細胞衰老；預處理selaginellin(10-7，3×10-7和10-6M)1h能顯著抑制Hcy誘導的β-半乳糖苷酶活性增加和端粒酶活性的降低，且呈濃度依賴性。 (3)Hcy(0.5×10-3M)處理內(nèi)皮細胞60 h，能顯著增加細胞內(nèi)ROS水平；預處理selaginellin(10-7，3×10-7和10-6M)1h能濃度依賴性地抑制Hcy誘導的細胞內(nèi)ROS水平