環(huán)巴胺阻斷Hedgehog通路對(duì)食管癌細(xì)胞的影響及分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　通過(guò)Hedgehog(Hh)信號(hào)途徑的特異性抑制劑環(huán)巴胺(cyclopamine)在體外干預(yù)食管癌細(xì)胞,觀察環(huán)巴胺在體外對(duì)食管癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,并探討其可能的分子機(jī)制,以期為環(huán)巴胺應(yīng)用于食管癌的治療提供實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。
　　方法:
　　體外培養(yǎng)人食管癌EC9706細(xì)胞株,用不同濃度環(huán)巴胺處理,通過(guò)MTT檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,了解環(huán)巴胺在體外對(duì)食管癌細(xì)胞的促凋亡作用;通過(guò)AO/EB雙熒光染色在細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面觀察環(huán)巴胺對(duì)

2、食管癌細(xì)胞的影響;通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)環(huán)巴胺對(duì)食管癌細(xì)胞凋亡的影響;通過(guò)Western blot檢測(cè)環(huán)巴胺對(duì)食管癌細(xì)胞中Gli-1蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1)MTT法實(shí)驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)不同濃度的環(huán)巴胺作用不同時(shí)間對(duì)EC9706細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,結(jié)果顯示DMSO組對(duì)EC9706細(xì)胞無(wú)明顯增殖抑制作用,與空白對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。環(huán)巴胺組(濃度分別為2.5、5、10、20μmol/L)對(duì)EC9706細(xì)胞生長(zhǎng)

3、均有顯著抑制作用,抑制作用隨濃度增大而增大,與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2)AO/EB雙熒光染色結(jié)果熒光顯微鏡下可見(jiàn)環(huán)巴胺組有特征明顯的早期凋亡細(xì)胞,并且凋亡細(xì)胞隨藥物濃度的增加而增多,見(jiàn)圖1?？梢?jiàn)細(xì)胞體積縮小,細(xì)胞變圓,邊緣毛糙,形成不規(guī)則突起,細(xì)胞核集,固縮。
　　3)EC9706細(xì)胞的凋亡情況使用Annexin FITC/PI雙染法后經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)定了不同濃度環(huán)巴胺作用EC9706細(xì)胞24h后細(xì)胞的凋亡率分別為

4、(7.73±1.25)％、(13.37±1.42)%、(22.3±1.92)%、(33.57±1.75)%,DMSO組細(xì)胞的凋亡率為(2.14±0.16)%,不加藥對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率(2.23±0.22)%,環(huán)巴胺對(duì)EC9706細(xì)胞有誘導(dǎo)其凋亡作用,不同濃度環(huán)巴胺組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),且細(xì)胞凋亡率隨環(huán)巴胺濃度增大而增加。見(jiàn)圖2。
　　4)Western blot結(jié)果不同濃度環(huán)巴胺處理細(xì)胞24h后,隨著藥

5、物濃度逐漸增加,Gli-1蛋白表達(dá)逐漸減少,而內(nèi)參β-actin蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。經(jīng)圖像處理系統(tǒng)分析,β-actin灰度值為參照,得出DMSO組和空白對(duì)照組無(wú)顯著差異(p>0.05),但環(huán)巴胺組與空白對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.01),并且具有濃度依賴性。見(jiàn)圖3。
　　結(jié)論:
　　1)Hedgehog信號(hào)通路在食管癌EC9706細(xì)胞中是被激活的。
　　2)環(huán)巴胺對(duì)人食管癌細(xì)胞株EC9706有生長(zhǎng)抑制作用,隨著藥物