寬體金線蛭抗凝物質(zhì)的分離純化及理化性質(zhì)研究.pdf

1、水蛭始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,歷代本草均有記述。中醫(yī)認(rèn)為水蛭具有破血、逐瘀、通經(jīng)之功能。近年來,它的醫(yī)用研究越來越廣泛,特別是水蛭中提取的抗凝物質(zhì),目前研究最多的是水蛭素。中國藥典(2000版)收錄的三個(gè)水蛭品種中,寬體金線蛭(Whitmania pigraWhitman)使用最廣泛,并且在我國廣泛養(yǎng)殖,另外兩個(gè)品種:日本醫(yī)蛭、柳葉金線蛭在我國養(yǎng)殖數(shù)量很少,現(xiàn)在藥廠使用的多數(shù)是寬體金線蛭。而關(guān)于寬體金線蛭活性成分國內(nèi)報(bào)道研究的很少,關(guān)于寬體

2、金線蛭中抗凝物質(zhì)的序列更是沒有報(bào)道。為了進(jìn)一步探討其抗凝作用的物質(zhì),本試驗(yàn)采用寬體金線蛭作為實(shí)驗(yàn)材料,對(duì)其含有的抗凝物質(zhì)進(jìn)行分離純化并進(jìn)行序列測定。
　　 本研究首先采用寬體金線蛭的鮮品與干品作為實(shí)驗(yàn)材料,用丙酮.三氯乙酸法和三氯乙酸法進(jìn)行粗提。結(jié)果表明：采用干品寬體金線蛭作為粗提材料,丙酮.三氯乙酸法作為提取方法時(shí),每克材料所得的粗品質(zhì)量0.394g,所得粗品比活力1.961IU3/mg。與采用干品作為實(shí)驗(yàn)材料,三氯乙酸法作為

3、實(shí)驗(yàn)方法相比,每克材料所得到粗品質(zhì)量與比活力均比后者要高；當(dāng)用鮮品作為實(shí)驗(yàn)材料時(shí),無論采用哪種方法,所得粗品質(zhì)量及比活均小于以干品作為實(shí)驗(yàn)材料的質(zhì)量及比活。因此本試驗(yàn)采用干品寬體金線蛭作為實(shí)驗(yàn)材料,丙酮.三氯乙酸法作為粗提方法。為分離得到單一蛋白質(zhì)并對(duì)提取方法進(jìn)行優(yōu)化,本試驗(yàn)采用不同柱填料進(jìn)行分離。采用Sephadex G-50時(shí)總活力回收率是52.174％,純化倍數(shù)18.390;采用Sephadex G-75時(shí)總活力回收率是59.62

4、7％,純化倍數(shù)8.294。在總活力回收率與吸收峰相近情況下,Sephadex G-50純化倍數(shù)要高于Sephadex G-75,因此我們采用Sephadex G-50作為凝膠過濾層析柱填料。對(duì)凝膠過濾層析得到的抗凝物質(zhì)進(jìn)行離子交換分離并且對(duì)不同柱填料進(jìn)行比較,結(jié)果表明:兩種不同柱填料DEAE—Separose CL-6B和DEAE-cellulose DE-52相比,DEAE-Separose CL-6B回收率與純化倍數(shù)(88.71％,

5、1.36)均大于DEAE-cellulose DE-52(68.98％,1.117),并且DEAE-Separose CL-6B分離后電泳結(jié)果顯示只有兩個(gè)蛋白質(zhì)條帶,DEAE-celluiose DE-52有三條蛋白條帶,因此采用DEAE-Separose CL-6B作為離子交換層析的柱填料。將陰離子交換得到的抗凝物質(zhì)進(jìn)行Sep-pak C18柱分離,經(jīng)過SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示,只有單一條帶,說明分離得到的抗凝物質(zhì)是電泳純的單一肽

6、鏈,分子量大約為14.9KD。對(duì)所得抗凝物質(zhì)進(jìn)行雙向電泳,只得到一個(gè)電泳斑點(diǎn),初步推算其等電點(diǎn).5.9。最后將所得的抗凝物質(zhì)PVDF轉(zhuǎn)膜,N端序列測定。根據(jù)等電點(diǎn)、分子量及測序結(jié)果分析,我們提取得到的抗凝物質(zhì)是一種新的蛋白質(zhì)。對(duì)分離得到的抗凝物質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)分析,結(jié)果表明分離純化得到的抗凝物質(zhì)是一種非常穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。溫度升高(100℃水浴)和pH(1—13)的改變不影響其活力。在某些變性劑(1％SDS、0.1mol/l DTT。和25％