超量表達(dá)和CREST沉默F(xiàn)BP29基因影響矮牽牛形態(tài)發(fā)育的研究.pdf

1、MADS-box基因編碼的蛋白是一類重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，廣泛存在真核生物中。植物MADS-box基因?qū)ζ錉I(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖發(fā)育過程都具重要作用。AP1/FUL亞家族是其中的一支，控制花萼和花瓣的A類基因基本屬于該亞家族，最先是在研究擬南芥和金魚草的突變體過程中發(fā)現(xiàn)的。大量研究表明，該亞家族基因不僅控制花器官的發(fā)育和形成，還在花序分生組織特征決定、開花時(shí)間，果實(shí)成熟、葉片發(fā)育等多方面具重要作用。矮牽牛中該亞家族的PFG基因研究發(fā)現(xiàn)，該基因不僅

2、對(duì)營(yíng)養(yǎng)生殖向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變有影響，還與生殖生長(zhǎng)狀態(tài)的保持有關(guān);共抑制植株的花朵表型無變化，推測(cè)該基因與矮牽?；òl(fā)育A功能無關(guān)。因此，通過對(duì)矮牽牛該亞族另一個(gè)基因FBP29的研究可進(jìn)一步探索該亞族基因的功能，豐富相關(guān)理論，促進(jìn)其在創(chuàng)造花卉新品種中的應(yīng)用。主要內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.矮牽牛FBP29基因的克隆及序列分析
　　根據(jù)已登錄的矮牽牛MADS-box轉(zhuǎn)錄因子FBP29(GeneBank登錄號(hào):AF335245.1)的c

3、DNA編碼框序列設(shè)計(jì)合成特異引物，以矮牽牛MD的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序比對(duì)后獲得目的片段。該基因最大ORF框738bp，編碼245個(gè)氨基酸。利用RACE技術(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了FBP29基因5'端和3'端非編碼區(qū)(UTR)序列，拼接后獲得FBP29基因的cDNA全長(zhǎng)序列。利用PCR擴(kuò)增獲得了FBP29編碼區(qū)的基因組序列，通過與cDNA序列的比較，對(duì)基因的內(nèi)含子情況進(jìn)行了分析。cDNA全長(zhǎng)序列有1377bp，ORF為738b

4、p，5'UTR為366bp，3'UTR為273bp;基因組序列全長(zhǎng)5781bp，含有8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子，其中第一個(gè)內(nèi)含子最大，為2.5kb。
　　BLAST protein分析初步推測(cè)FBP29基因?qū)儆谥参锾赜械腗IKC型MADS-box基因。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，該基因?qū)儆贏P1/FUL亞家族的FUL-like進(jìn)化分支。多序列比對(duì)分析表明FBP29基因與AP1/FUL基因（金魚草DEFH28和葡萄VFUL-L等）具有較高的同源性

5、，C末端含有FUL-like基序。
　　2.矮牽牛FBP29基因在各組織中的表達(dá)分析
　　半定量PCR檢測(cè)FBP29基因在矮牽牛各組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示:該基因在各組織中除根外，莖、葉和花蕾中均有表達(dá)，且表達(dá)量依次升高;在花器官各部位中均有表達(dá)，花萼中最高，花瓣和雄蕊弱表達(dá)。
　　3.矮牽牛FBP29基因功能的初步分析
　　將目的基因FBP29和FBP29∷SRDX分別連接到植物表達(dá)載體上，構(gòu)建植物超量表達(dá)載體和

6、CRES-T沉默載體，轉(zhuǎn)化矮牽牛，經(jīng)Basta篩選、PCR檢測(cè)分別獲得25、32個(gè)遺傳轉(zhuǎn)化系。表型觀察發(fā)現(xiàn):超量表達(dá)T0代轉(zhuǎn)基因植株分枝減少、葉片略有變小，花朵無表型變化，但是花期提前，結(jié)實(shí)后花柱不脫落;CRES-T沉默T0代轉(zhuǎn)基因植株花筒顏色綠色加深，部分株系花冠筒外圍出現(xiàn)1-5個(gè)額外不規(guī)則花瓣;冠檐明顯變小，維管束呈綠色，尖部類似萼片狀;CRES-T沉默T1代轉(zhuǎn)基因植株明顯矮小，莖節(jié)間短;葉片明顯變小，顏色綠色加深，出現(xiàn)不對(duì)稱現(xiàn)象，