丙型肝炎病毒的制備及其感染的肝細胞對TRAIL敏感性的機制研究.pdf

1、目的:在本實驗室建立產(chǎn)生感染性HCV的細胞模型,監(jiān)測HCV滴度隨時間變化的曲線,從而大量制備高滴度的感染性病毒用于HCV的各項研究。我們用制備的HCV感染正常肝細胞和肝癌細胞,比較感染前后對TRAIL誘導的凋亡的敏感性變化,初步探索其凋亡變化機制,以期發(fā)現(xiàn)新的靶基因或方法,為丙型肝炎和丙型肝炎所致肝癌的治療提供一定的理論基礎。
　　方法:1.將FL-JFH1質粒擴增、酶切鑒定后,體外逆轉錄FL-JFH1并純化,然后電轉至Huh7.

2、5.1,常規(guī)傳代培養(yǎng)轉染后的Huh7.5.1,收集14天左右的細胞培養(yǎng)上清。利用此JFH1上清按照MOI=0.1和MOI=1感染Huh7.5.1,特定時間點收集細胞培養(yǎng)上清。利用HCV熒光定量PCR測定HCV滴度,繪制HCV滴度隨時間變化的曲線,以便大量制備JFH1上清。
　　2.用MTT法,先確定正常肝細胞LO2和肝癌細胞Huh7.5對病毒及TRAIL處理的最佳時間及劑量后,再檢測正常肝細胞LO2和肝癌細胞Huh7.5分別用50

3、ng/mlTRAIL處理、HCV感染及用HCV感染加50ng/mlTRAIL處理后,與對照細胞相比,各實驗組細胞死亡或凋亡情況。
　　3.用RT-PCR以及Western blot,檢測正常肝細胞LO2和肝癌細胞Huh7.5分別用50ng/mlTRAIL處理、HCV感染及用HCV感染加50ng/mlTRAIL處理后,與對照細胞相比,其與TRAIL凋亡信號途徑相關的分子如DR4,DR5,c-FLIP(L)在mRNA以及蛋白質水平的變

4、化情況。
　　結果:1.JFH1按照MOI=0.1和MOI=1分別感染Huh7.5.1后,兩者JFH1滴度在感染第8天MOI=1略高于MOI=0.1,第12天基本持平并達到最高值,兩周后變化基本相同。2.MTT結果顯示,LO2對TRAIL不敏感,感染HCV后對TRAIL變得敏感;Huh7.5對TRAIL敏感,感染HCV后變得對TRAIL更加敏感。
　　3.在LO2細胞中,DR4、DR5 mRNA在各組中無明顯變化,c-FLI

5、P(L) mRNA在JFH1+TRAIL組中降低,但c-FLIP(L)蛋白水平卻有所上升;在Huh7.5細胞中,DR4 mRNA在JFH1+TRAIL組中下降,DR5 mRNA在各組中無明顯變化,c-FLIP(L)在TRAIL組、JFH1組、JFH1+TRAIL組中降低。蛋白檢測發(fā)現(xiàn)DR5在JFH1+TRAIL組中略有上升,而c-FLIP(L)則顯著下降。
　　結論:正常細胞LO2感染HCV后對TRAIL敏感的機制不是通過DR4、