小麥-簇毛麥抗白粉病相關(guān)基因的轉(zhuǎn)化及功能鑒定.pdf

1、小麥白粉病是由白粉病菌(Ergsiphe graminis f.sp.tritici)引起的專性寄生真菌病害,在中國和世界小麥生產(chǎn)中危害日趨嚴(yán)重。由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞遺傳所發(fā)現(xiàn)的簇毛麥抗白粉病基因Pm21,對白粉病抗性強(qiáng)、抗譜廣,已通過選育易位系途徑導(dǎo)入普通小麥并被定位于6V染色體的短臂上.克隆Pm21基因并利用基因工程手段將其導(dǎo)入綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的小麥品種中,對提高小麥白粉病抗性具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)室在分離克隆抗白粉病基因研究中,已獲得

2、包括Pm21基因候選克隆在內(nèi)的多個(gè)抗病相關(guān)基因。為了進(jìn)一步鑒定這些抗病相關(guān)基因的抗性效應(yīng),本研究在優(yōu)化小麥組織培養(yǎng)再生體系基礎(chǔ)上,利用基因槍方法轉(zhuǎn)化,將這些基因?qū)敫胁⌒←溒贩N,獲得了一批轉(zhuǎn)基因植株并對它們進(jìn)行了分子檢測和抗病性鑒定。 為建立適于優(yōu)良小麥品種遺傳轉(zhuǎn)化的高效組織培養(yǎng)體系,以20個(gè)優(yōu)良小麥推廣品種為試材,對以幼胚為外植體的愈傷誘導(dǎo)、分化和生根壯苗培養(yǎng)基進(jìn)行篩選.試驗(yàn)結(jié)果表明,添加500mg/L水解酪蛋白、100mg/

3、L脯氨酸、100mg/L谷氨酰胺,并以40g/L麥芽糖為碳源的MXD2培養(yǎng)基的出愈率最高,愈傷質(zhì)量最好。以大量元素減半的1/2 MX為基本分化培養(yǎng)基,添加1mg/L ZT和0.5mg/L IAAM對愈傷組織誘導(dǎo)分化的效果最好,分化率最高達(dá)到83.0％.以1/2 MX培養(yǎng)基中添加0.5mg/L IAA和0.5mg/L MET的生根效果最好,且移栽成活率高.不同基因型的組織培養(yǎng)特性差異顯著,本研究篩選到揚(yáng)麥158、南農(nóng)9918、濟(jì)麥20、寧

4、麥9號等8個(gè)基因型可作為優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因受體材料,并初步建立起適合于它們的植株再生體系。同時(shí)為拓寬小麥組織培養(yǎng)外植體的范圍,對揚(yáng)麥158的成熟胚和幼穗的再生培養(yǎng)體系也進(jìn)行了有益的探索。分別以揚(yáng)麥158的幼胚、幼穗、成熟胚為外植體,在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加不同激素組合,觀察它們對愈傷組織誘導(dǎo)率、直接發(fā)芽率、分化率和愈傷組織質(zhì)量、重量、生長速率的影響,建立起適合不同外植體的植株再生體系。 本研究構(gòu)建了包括小麥類甜蛋白基因Ta-Tlp、小麥Ml

5、o反義基因、簇毛麥谷胱甘肽還原酶基因Hv-GR和Pm21基因的候選克隆簇毛麥絲氨酸/蘇氨酸激酶基因Hv-S/TPK等多個(gè)抗白粉病相關(guān)基因的植物高效表達(dá)載體。在表達(dá)載體中均采用來源于玉米泛素基因的單子葉植物高效啟動子ubi為目標(biāo)基因的啟動子,除草抗性基因bar為植物選擇標(biāo)記.通過基因槍將其導(dǎo)入到小麥品種揚(yáng)麥158的幼胚愈傷組織中,采用上述優(yōu)化的再生培養(yǎng)方案,在含bialaphos的選擇培養(yǎng)基上經(jīng)兩輪篩選和分化,分別獲得了這些基因的除草劑抗

6、性再生植株。通過對T0代再生植株進(jìn)行PCR、Southern雜交與RT-PCR分析,獲得轉(zhuǎn)Ta-Tlp基因陽性植株27株,轉(zhuǎn)小麥Mlo反義基因陽性植株45株,轉(zhuǎn)Hv-GR陽性植株23株,轉(zhuǎn)Hv-S/TPK陽性植株97株,平均轉(zhuǎn)化率達(dá)到1.32％,轉(zhuǎn)入的外源基因多數(shù)為多個(gè)拷貝。對T0代及其衍生的T1、T2代轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行白粉病抗性鑒定,結(jié)果表明,Ta-Tlp基因超量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株,能延緩白粉病發(fā)病進(jìn)程,但其T2代陽性轉(zhuǎn)化植株的赤霉病抗性與

7、受體對照無顯著差異；部分轉(zhuǎn)小Mlo反義基因的株系表現(xiàn)對白粉病中感到高抗；轉(zhuǎn)Hv-GR基因植株的谷胱甘肽的氧化還原狀態(tài)發(fā)生了改變,內(nèi)源病程相關(guān)基因PR-1a和PR-5被誘導(dǎo)表達(dá),進(jìn)而在一定程度上提高了轉(zhuǎn)化植株對白粉病的抗性；值得注意的是轉(zhuǎn)Hv-S/TPK基因的植株在整個(gè)生育期均表現(xiàn)高抗白粉病,葉片上僅有過敏性壞死斑和少量孢子堆出現(xiàn)。此外,還構(gòu)建了包含Ta-LRR2基因的的植物表達(dá)載體pBI-LRR2,利用基因槍法將pBI-LRR2和攜帶b

8、ar基因的表達(dá)載體pAHC25共轉(zhuǎn)化,以高感白粉病的小麥品種揚(yáng)麥158幼胚愈傷為受體,對轉(zhuǎn)化再生植株進(jìn)行PCR、Southern雜交與RT-PCR等分子檢測,獲得轉(zhuǎn)Ta-LRR2基基因T0代陽性植株89株。對T0代和T1轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行白粉病人工接種的抗性鑒定,轉(zhuǎn)化植株苗期多數(shù)葉片僅有過敏性壞死斑出現(xiàn),表現(xiàn)為高抗白粉??；灌漿期大部分陽性植株雖有不同程度的發(fā)病,但僅在倒三葉以下及基部葉片,表現(xiàn)中抗白粉病。同時(shí)在T1代篩選到了92株只有目標(biāo)基因